Одновременно Захват изображения в реальном времени в двух выбросов каналов Использование Разделение системы двойной камеры выбросов: Заявки на клеточной адгезии
Summary
Двойная камера выбросов системы расщепления для двухцветной флуоресцентной микроскопии генерировать в реальном времени последовательности изображений с исключительной оптической и временным разрешением, требования некоторых живых клеток анализов в том числе параллельных Проточная камера пластина адгезии анализов. Когда программное обеспечение используется для объединения изображений с одновременно приобретенных каналов выбросов, псевдоцветной последовательности изображений производятся.
Abstract
Многоцветный иммунофлюоресценции микроскопии для обнаружения специфических молекул в мембране клетки могут быть связаны с параллельными камерных поток пластина анализов для исследования механизмов, регулирующих клеточную адгезию в динамических условиях потока. Например, раковые клетки, меченные нескольких флуорофорами можно перфузии над потенциально реактивной субстрат для моделирования механизмов раковых метастаз. Тем не менее, многоканальные системы одной камеры и цветные камеры проявляют недостатки в получения изображений для анализа в реальном времени живых клеток. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы использовали двойной камеры выбросов систему расщепления одновременно захватить в режиме реального времени изображения последовательности флюоресцентно меченых клеток в камере потока. Выбросов системы расщепления двойной камеры фильтр определен диапазонов длин волн на две монохромный ПЗС-камер, тем самым одновременно захватив два пространственно одинаковые, но флуорофорные конкретных изображений. Впоследствии psuedocolored изображения одноканальные объединены в одинв режиме реального времени последовательность, которая может выявить несколько молекул-мишеней на клетки быстро движется по интересующей области объединены.
Introduction
Методы анализа молекул на поверхности клеток, таких как иммунным окрашиванием, использовать зонды, которые химически конъюгированных с флуорофоров, что позволяет обнаруживать молекул-мишеней. Живая клетка изображений и гидродинамического потока на основе клеточной адгезии анализы обычно записываются с монохромными ПЗС-камер, предназначенных для захвата физиологические процессы на клеточном и / или молекулярном уровне 1, 2. Эти камеры обладают высокой чувствительностью, доставить высокую частоту кадров (более 30 кадров в секунду), и обеспечивают исключительную временное разрешение (в связи с высокой частотой смены кадров и коротким временем воздействия). Тем не менее, черно-белых камер можно только захватить один канал эмиссии (обнаружения одного флуорофора) для сбора изображений. Холост системы расщепления выбросов камера может быть включена, чтобы захватить несколько каналов выбросов, но часто уменьшить поле зрения и требуют такого же времени экспозиции для визуализации всех каналов. Для захвата полный цветовой спектр из клеток, меченных MULTIPле флуорофоры, цветная камера может использоваться в качестве альтернативы. Тем не менее, цветные камеры обычно не способны обеспечить требуемую временное разрешение для живого изображения клетки в определенных приложениях. Другое устройство формирования изображения необходим для приложений, в которых целесообразно изображений живых клеток на множественных длинах волн, сохраняя высокое временное разрешение. Ярким экспериментальный приложение является параллельной проточной камеры пластина адгезия анализ, в котором клетки перфузии в физиологически соответствующих условий в течение потенциально реакционноспособного подложки 1, 3. Клетки, которые экспрессируют потока специфические молекулы клеточной поверхности могут прилипать и рулон на подложке, такой как клеточный монослой экспрессии молекул адгезии или поверхностно-адсорбированный белки внеклеточного матрикса 4, 5. Прокатные клетки могут пройти вращения и поступательное движение в доли секунды. Молекулярные особенности на прокатки и адгезивных клеток, таких как кластеры молекул клеточной поверхности, также имеют потенциометраль пройти активное реорганизации на поверхности клетки. Таким образом, системы визуализации должны предоставить исключительное временное разрешение (30 кадров в секунду или более и "около нуля" время экспозиции) для создания последовательности изображений, которая иллюстрирует шаг за шагом прогрессирование клеток прокатки 6, 7. Системы расщепления выбросов Двойная камера способна удовлетворить эти требования для работы с изображениями клетки помечены с несколькими флуорофорами.
Системы расщепления выбросов Двойная камера разделена и флуоресценции фильтр каналов в двух аналогичных камер одновременно захватить два пространственно одинаковые, но флуорофорные конкретных изображений, сохраняя при этом полный обзор. Эта технология позволяет прямое сравнение изображения, снятого в режиме реального времени в каждом канале и позволяет пользователю быстро переключаться между моделями камер с различными возможностями визуализации. Эта функция полезна для внесения изменений в настройки захвата изображения в одной камере, что лучше позволить системе, чтобы захватитьфлуорофоры с разной интенсивностью, жизни и коэффициентов экстинкции 8. В сочетании с ПО для обработки изображений, двойные выбросов системы расщепления камеры позволяют в режиме реального времени записи живых анализов изображений клеток в нескольких длинах волн и может повысить анализов в пробирке, которые используют флуоресценцию изучать поведение клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Двойная камера выбросов система расщепления имеет пространственное, временное, и оптическое разрешение, необходимое для захвата изображений высокого качества в приложениях, где клетки или молекулярный движение быстро. В генерации репрезентативные результаты, параметры в двойной эм?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Дугласа Гетц (кафедры химической и биомолекулярных инженерия, Университет Огайо) и д-р Фабиан Benencia (отдел медико-биологических наук, Университет Огайо) для проницательных дискуссий и рецензированию рукописей. Мы также благодарим доктора Кристофера Huppenbauer за полезные обсуждения технических вопросов (У. Nuhsbaum Inc.) Эта работа была поддержана грантами от Национального научного фонда (CBet-1106118) и Национального института здоровья (1R15CA161830-01).
Materials
| Reagent/Material | |||
| BT-20 cells | ATCC | HTB-19 | |
| CHO-E cells | Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School) | ||
| MEM | Thermo Scientific | SH30024.01 | |
| FBS | Thermo Scientific | SH30396.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin / 0.1% EDTA | Thermo Scientific | SV30031.01 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| HECA-452 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555946 | |
| Anti-human CD24 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555426 | |
| Anti-rat IgM AlexaFluor 488 | Invitrogen | A21212 | |
| Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera | Q Imaging | EXI-BLU-R-F-M-14-C | |
| Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera | Q Imaging | RET-EXi-F-M-12-C | |
| DC2 Emission Splitter | Photometrics | DC2 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Streampix 5 software | Norpix |
Referenzen
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).
- Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).
- Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).
- Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).
- Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
- Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).
- Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?. Front. Oncol. 2, 103 (2012).
- Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
- Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).
- Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).
- Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
- Worth, D. C., Parsons, M. Advances in imaging cell-matrix adhesions. J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).
- Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).
