La captura simultánea imágenes en tiempo real en los dos canales de emisión mediante un sistema de división de doble cámara de emisiones: Las solicitudes de adhesión de células
Summary
Sistemas que dividen las emisiones de cámara dual para dos colores microscopía de fluorescencia generan secuencias de imágenes en tiempo real con una resolución óptica excepcional y temporal, una exigencia de ciertos ensayos de células en vivo, incluyendo ensayos de adhesión cámara de flujo de placas paralelas. Cuando se emplea software para fusionar las imágenes de los canales de emisión adquiridos simultáneamente, se producen secuencias de imágenes pseudocoloreada.
Abstract
Multi-color de inmunofluorescencia microscopía para detectar moléculas específicas en la membrana celular se puede acoplar con ensayos de cámara de flujo de placas paralelas para investigar los mecanismos que regulan la adhesión celular en condiciones de flujo dinámico. Por ejemplo, las células cancerosas etiquetado con múltiples fluoróforos pueden ser perfundidos sobre un sustrato potencialmente reactivo para modelar los mecanismos de la metástasis del cáncer. Sin embargo, los sistemas de cámara única de múltiples canales y cámaras de color presentan deficiencias en la adquisición de imágenes para el análisis de células vivas en tiempo real. Para superar estas limitaciones, se utilizó un sistema de división de las emisiones de doble cámara para capturar simultáneamente secuencias de imágenes en tiempo real de las células marcadas con fluorescencia en la cámara de flujo. Longitud de onda de emisión de la división de sistemas de filtro de la cámara dual definido oscila en dos cámaras CCD monocromo, capturando con ello simultáneamente dos imágenes idénticas pero espacialmente fluoróforo específico. Posteriormente, psuedocolored imágenes de un canal se combinan en un soloen tiempo real se fusionó secuencia que puede revelar múltiples moléculas diana en las células que se mueve rápidamente a través de una región de interés.
Introduction
Métodos para el análisis de moléculas en la superficie celular, tales como la inmunotinción, emplean sondas que se conjugan químicamente a fluoróforos, que permite la detección de moléculas diana. Imágenes de células en vivo y ensayos de adhesión celular basados en el flujo hidrodinámico se registran de cámaras CCD monocromo diseñadas para capturar los procesos fisiológicos a nivel celular y / o molecular de nivel 1, 2. Estas cámaras son muy sensibles, entregar velocidades de cuadro rápidas (más de 30 cuadros por segundo), y proporciona una resolución temporal excepcional (debido a velocidades de cuadro rápidas y tiempos de exposición cortos). Sin embargo, las cámaras monocromas sólo pueden capturar un solo canal de emisión (la detección de un solo fluoróforo) para recoger imágenes. Sistemas individuales de división de emisión de la cámara se pueden incorporar para capturar múltiples canales de emisión, pero a menudo reducen el campo de visión y requieren el mismo tiempo de exposición para obtener imágenes de todos los canales. Para capturar el espectro de color de las células marcadas con multíparaLe fluoróforos, una cámara de color se puede utilizar como una alternativa. Sin embargo, las cámaras en color generalmente no son capaces de proporcionar la resolución temporal deseado para imágenes de células vivas en ciertas aplicaciones. Se necesita otro dispositivo de formación de imágenes para aplicaciones en las que es ventajosa para las células vivas de la imagen en múltiples longitudes de onda al tiempo que conserva una alta resolución temporal. Una aplicación experimental principal es el ensayo de adhesión cámara de flujo de placas paralelas, en el que las células se sometieron a perfusión en condiciones fisiológicamente relevantes sobre un sustrato potencialmente reactivo 1, 3. Las células en el flujo que expresan moléculas de superficie celular específicos pueden adherirse y rodillo sobre el sustrato, tal como una monocapa de células que expresan moléculas de adhesión o las proteínas de la matriz extracelular adsorbido en la superficie 4, 5. Células rodantes pueden experimentar el movimiento de rotación y traslación en fracciones de segundo. Características moleculares en la rodadura y las células adherentes, tales como grupos de moléculas de superficie celular, también tienen el potenciómetroAl someterse a la reorganización activa en la superficie celular. Por lo tanto, los sistemas de imágenes deben proporcionar una resolución temporal excepcional (30 cuadros por segundo o superior y "cerca de cero" tiempos de exposición) para generar una secuencia de imágenes que ilustra la progresión paso a paso de la celda de rodadura 6, 7. Sistemas que dividen las emisiones cámara dual son capaces de satisfacer estas demandas de imágenes de células marcadas con múltiples fluoróforos.
Sistemas de división de emisión dual de la cámara se separaron y canales de fluorescencia del filtro en dos cámaras similares para capturar simultáneamente dos imágenes espacialmente idénticos pero fluoróforo específica al tiempo que conserva el campo de visión completo. Esta tecnología permite la comparación directa de la imagen capturada en tiempo real en cada canal y permite al usuario cambiar rápidamente entre los modelos de cámara con diferentes capacidades de imagen. Esta característica es útil para realizar ajustes en la configuración de captura de imágenes en una cámara que mejor permitir que el sistema para capturarfluoróforos con diferentes intensidades, tiempos de vida, y los coeficientes de extinción 8. Junto con el software de imágenes, sistemas de división de emisión de cámaras duales permiten la grabación en tiempo real de análisis de imágenes de células vivas en múltiples longitudes de onda y pueden mejorar los ensayos in vitro que utilizan la fluorescencia para estudiar el comportamiento celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema de fraccionamiento de emisiones de doble cámara tiene la resolución espacial, temporal y óptica necesaria para capturar imágenes de alta calidad en aplicaciones en las células o el movimiento molecular es rápida. En la generación de los resultados representativos, los parámetros del sistema de división de la emisión de la cámara dual, incluida la configuración de software y configuración de la cámara, fueron optimizados para obtener una secuencia de imagen combinada en el que a la rodadura y las…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Douglas Goetz (Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular de la Universidad de Ohio) y el Dr. Fabian Benencia (Departamento de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Ohio) para discusiones interesantes y revisión del manuscrito. También agradecemos al Dr. Christopher Huppenbauer para discusiones técnicas útiles (W. Nuhsbaum Inc.). Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencia (CBET-1106118) y los Institutos Nacionales de Salud (1R15CA161830-01).
Materials
| Reagent/Material | |||
| BT-20 cells | ATCC | HTB-19 | |
| CHO-E cells | Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School) | ||
| MEM | Thermo Scientific | SH30024.01 | |
| FBS | Thermo Scientific | SH30396.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin / 0.1% EDTA | Thermo Scientific | SV30031.01 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| HECA-452 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555946 | |
| Anti-human CD24 monoclonal antibody | BD Biosciences | 555426 | |
| Anti-rat IgM AlexaFluor 488 | Invitrogen | A21212 | |
| Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera | Q Imaging | EXI-BLU-R-F-M-14-C | |
| Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera | Q Imaging | RET-EXi-F-M-12-C | |
| DC2 Emission Splitter | Photometrics | DC2 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Streampix 5 software | Norpix |
Referenzen
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