Une puce microfluidique pour l'analyse chimique polyvalente de cellules isolées

Summary

Dans cet article, nous présentons une puce microfluidique pour l'analyse d'une seule cellule. Il permet la quantification des protéines intracellulaires, des enzymes, des cofacteurs, et des seconds messagers à l'aide de dosages ou des dosages immunologiques par fluorescence.

Abstract

On présente un dispositif microfluidique qui permet la détermination quantitative de plusieurs biomolécules intracellulaires dans des cellules individuelles en parallèle. A cette fin, les cellules sont piégées dans passivement au milieu d'une microchambre. Lors de l'activation de la couche de contrôle, la cellule est isolée du volume entourant dans une petite chambre. Le volume entourant peut alors être échangé sans affecter la cellule isolée. Toutefois, à la courte ouverture et la fermeture de la chambre, la solution dans la chambre peut être remplacé à quelques centaines de millisecondes. En raison de la réversibilité des chambres, les cellules peuvent être exposées à des solutions différentes de manière séquentielle dans un mode hautement contrôlable, par exemple pour l'incubation, le lavage, et finalement, la lyse des cellules. Les microchambres hermétiques permettent le maintien du lysat, réduire et contrôler la dilution après lyse cellulaire. Depuis la lyse et l'analyse se produisent au même endroit, haute sensibilité est conservée, car aucune autre dilution ou de la perte des analytes se produit pendant le transport. La conception de la microchambre permet donc l'analyse fiable et reproductible de très petits nombres de copies de molécules intracellulaires (attomoles, zeptomoles) libérés à partir de cellules individuelles. En outre, de nombreuses chambres miniatures peuvent être disposés dans un format de réseau, ce qui permet l'analyse de plusieurs cellules à la fois, étant donné que les instruments optiques appropriés sont utilisés pour la surveillance. Nous avons déjà utilisé la plate-forme pour les études de preuve de concept pour analyser les protéines intracellulaires, des enzymes, des cofacteurs et des seconds messagers manière quantifiable soit relative ou absolue.

Introduction

De nombreuses études dans le passé ont révélé des différences de cellule à cellule dans une grande population de cellules ^1-3, en particulier les processus de signalisation ^4, ou les quantités de biomolécules telles que les protéines intracellulaires ^5,6, des métabolites et des cofacteurs ^7,8. Ces hétérogénéités sont considérés comme d'une importance fondamentale pour l'adaptation de la cellule et de l'évolution ^9, mais aussi jouer un rôle clé dans l'émergence et le traitement de maladies telles que le cancer ^10-13. Par conséquent, les études sur le niveau de la cellule sont d'un grand intérêt dans la recherche biologique et pharmacologique, en particulier si ces études révèlent les différentes réponses cellulaires après traitement avec des substances chimiques bioactives.

Au cours des dernières années, plusieurs plates-formes d'analyse ont été mises au point qui facilite l'analyse des cellules vivantes simples ou la composition chimique du contenu des cellules. Bien cellulaire activé par fluorescence (FACS) est l'or standard pour analyse à très haut débit de cellules vivantes individuelles, le procédé ne peut pas être utilisé pour la quantification des composés intracellulaires ou sécrétées. L'émergence de plates-formes microfluidiques a promis stratégies d'analyse nouveaux pour le positionnement, le traitement et l'observation des cellules individuelles. Une étape importante dans la microfluidique a été conclu avec l'intégration des vannes flexibles PDMS réalisés par Quake et collègues ^14,15. Ces vannes sont utiles car ils peuvent isoler des régions sur la puce, par exemple séparer deux cultures ^16. En outre, ils sont particulièrement applicable pour l'analyse d'une seule cellule et d'aider à réduire les problèmes de dilution analyte donc. La puissance de cette approche pour l'analyse unicellulaire a été démontré récemment par Hansen et ses collègues, qui ont analysé l'expression des gènes de centaines de cellules uniques en parallèle ^17.

Lorsque le ciblage des protéines et des métabolites, l'analyse est très difficile en raison de l'absence d'un convenableModes de mplification, le grand nombre de différents composés présents, et de leurs variations de nature chimique. En outre, la plupart des biomolécules intracellulaires sont tenus d'être présents à faible nombre de copies de l'ordre de quelques dizaines de milliers ^18, où la méthode d'analyse utilisée doit avoir une haute sensibilité. Des dosages plus puissants, tels que des dosages immunologiques et des dosages immunoenzymatiques (ELISA) sont difficiles à intégrer dans des dispositifs microfluidiques, car ils nécessitent plusieurs étapes de lavage et d'incubation ainsi que l'immobilisation de surface.

En raison de ces défis, il n'est pas surprenant que seuls quelques exemples ont été signalés où des protéines ou des métabolites ont été quantifiés sur le niveau de la cellule. Par exemple, des études sur la sécrétion de composés fluorescents ont été rapportés ^19,20. Récemment, la mise en œuvre par ELISA a été présenté pour l'analyse des sécrétées (non fluorescentes) des protéines à partir d'une culture cellulaire (cellules THP-1) ²¹ et seul (immune) cellules ^10. Le ciblage des protéines intracellulaires, Shi et al. Mis au point un dispositif microfluidique qui a facilité l'identification des protéines intracellulaires pour l'analyse des voies de signalisation des cellules tumorales au moyen d'un immuno-essai ^11. Cependant, seules des quantités relatives de protéines ont été déterminées et aucune amplification enzymatique a été utilisée pour augmenter le signal pour les protéines de faible abondance.

Récemment, nous avons été en mesure de combiner un micro-dispositif de piégeage seule cellule avec des essais de fluorescence ⁸ et immunoessais ²² (Figure 1). Les cellules sont passivement piégés dans des structures de haies micronisée, qui permettent l'approvisionnement et l'échange de milieu et d'autres agents chimiques, sans aucun mouvement des cellules (rapide). Une soupape en forme d'anneau autour de chaque piège permet l'isolement de la cellule dans un très petit volume ("la microchambre"). Cette vanne est actionné immédiatement après l'introduction d'un tampon de lyse cellulaire (hypoosmolaire), ilnce prévenir molécules intracellulaires ou molécules sécrétées à diffuser à distance. Plus important, en raison de la petite taille du volume (625 pl) à grande dilution des molécules est évitée. En outre, étant donné que la lyse et l'analyse sont effectuées dans la même position dans la puce, il n'y a pas de perte d'analytes dues au transport. La conception de la puce décrite ici comprend 8 rangées alternées de soit 7 ou 8 microchambres, totalisant 60 microchambres. Les chambres sont actionnés en rangées, de sorte que la contamination croisée le long d'une ligne est exclue.

La plate-forme peut être utilisée en combinaison avec des essais de fluorescence, ainsi que des dosages immunologiques (figure 1d). Dans ce dernier cas, nous avons établi des protocoles pour l'immobilisation des anticorps, qui sont compatibles avec la production de puces et le processus d'assemblage. D'où la plate-forme ouvre la voie à des méthodes sensibles, fiables et quantifiables au niveau de la cellule unique. Jusqu'à maintenant, nous avons utilisé le dispositif pour l'analyse des ienzymes sécrétées (ntracellular et quantification relative par dosages enzymatiques), des cofacteurs intracellulaires, des protéines et des petites molécules (de quantification absolue par des analyses de point de terminaison ou ELISA). Dans ce qui suit, nous décrirons le processus de fabrication de puces au moyen de la lithographie molle multicouche et les protocoles pour la structuration des anticorps au moyen de l'impression par microcontact et la chimie de surface. De plus, quelques exemples d'utilisation de la puce et les opérations sont donnés.

Protocol

Une. SU-8 de fabrication de Maître Préparer deux moules maîtres pour les canaux (fluidiques et de contrôle, pour les schémas et les dimensions, voir la figure 2) avec le protocole suivant, mais avec des schémas de masquage. Le procédé est représenté sur la figure 3a. Commencer par chauffage d'une tranche de silicium de 4 pouces pendant 10 min à 180 ° C. Chargez la plaquette déshydraté sur un spin-coater et utiliser le protocole suiv…

Representative Results

Notre plate-forme est capable d'analyser une série de intracellulaire ainsi que des molécules sécrétées présentes dans ou produit par des cellules individuelles. Ici, nous aimerions vous présenter les différentes études d'exemple pour souligner la variété des tests possibles. Nous donnerons un exemple pour une enzyme sécrétée (figure 5a) ainsi que d'une enzyme intracellulaire (Figure 5b) et de la protéine (Figures 5c et d). Po…

Discussion

technologie microfluidique a ouvert des possibilités nouvelles et fascinantes pour l'analyse unicellulaire. En particulier, la possibilité de piéger et d'immobiliser les cellules individuellement par des outils microfluidiques a permis des études systématiques à court et à long terme sur les propriétés unicellulaires et réponse. De plus, l'encapsulation des cellules dans des micro-gouttelettes de fréquences élevées, générées sur une puce, a permis des études de sécrétion des cellules simpl…

Materials

REAGENTS:
Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)	n.a.
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane	ABCR (Karlsruhe, Germany)	AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate	Sigma Aldrich	M9763
Acetone	Merck VWR (Darmstadt, Germany)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)	n.a.
AZ 726 developer	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)	n.a.
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A-4503
Bovine serum albumin, biotin	Sigma Aldrich	A-8549
Cell dissociation buffer	Invitrogen	13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
Hydrochloric acid	Fluka	84422
Isopropanol	Merck VWR (Darmstadt, Germany)	109634
Magnesium chloride hexahydrate	Fluka	63068
MR developer 600	Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)	n.a.
PBS	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG grafted	SuSoS, (Dübendorf, Switzerland)	n.a.
PLL-g-PEG grafted biotin	SuSoS, (Dübendorf, Switzerland)	n.a.
Potassium chloride	Fluka	60132
Protein G, biotin	Sigma Fine Chemicals	41624
Silicon wafer	Si-Mat (Kaufering, Germany)	n.a.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Biorad	1610716
Tween 20	Biorad	1706531
EQUIPMENT:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
0.22 µm PES syringe filter	TRP	99722
1/1.5 mm biopsy puncher	Miltex, York PA	33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µm	Partec	04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.
Hotplate HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Switzerland	n.a.
MA-6 mask aligner	Karl Suess	n.a.
Multizoom AZ100M microscope	Nikon Corporation	n.a.
Photomask	Microlitho, Essex, U.K.	n.a
Plasma Cleaner PDC-32G	Harrick	n.a.
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.
Spin Modules SM 180 BM	Sawatec, Sax, Switzerland	n.a.
Step profiler Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.
Syringe pump neMESYS	Cetoni	n.a.