単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ
Summary
この記事では、単一細胞解析のためのマイクロ流体チップを提示する。これは、蛍光アッセイまたはイムノアッセイによって細胞内タンパク質、酵素、補因子、およびセカンドメッセンジャーの定量化を可能にする。
Abstract
私たちは、並行して複数の単一細胞における細胞内の生体分子の測定を可能とマイクロ流体デバイスを提供する。この目的のために、細胞を、受動的にマイクロチャンバーの中央に閉じ込められている。制御層の活性化の際に、細胞は、小さなチャンバ内の周囲の容積から隔離される。周囲の容積は、次いで、単離された細胞に影響を与えることなく交換することができる。しかしながら、チャンバの短い開閉時に、チャンバー内の溶液が数百ミリ秒以内に交換することができる。によるチャンバの可逆性のために、細胞は、インキュベーション、洗浄、そして最後に、細胞溶解のために、例えば、高度に制御可能な様式で異なる溶液を順次に露光することができる。密閉マイクロチャンバは、細胞溶解後の希釈を最小限にし、制御し、溶解物の保持を可能にする。溶解および分析は、同じ場所で発生しているため、高感度が、それ以上のDので保持されている分析物のilutionまたは損失は、輸送中に発生します。マイクロチャンバーの設計は、したがって、個々の細胞から放出され、細胞内の分子の非常に小さなコピー数（アトモル、ゼプトモル）の信頼性と再現性の分析を可能にします。さらに、多くのマイクロチャンバは、適切な光学機器を監視するために使用されることを考えると、一度に多くの細胞の分析を可能にするアレイ形式に配置することができる。我々はすでに、細胞内タンパク質、酵素、補因子および相対または絶対定量化可能な方法で、セカンドメッセンジャーを分析するための概念実証研究のためのプラットフォームを使用しています。
Introduction
過去の多くの研究は、特定のシグナル伝達プロセス4、またはこのようなタンパク質は、5,6、代謝産物、および補因子7,8のような細胞内の生体分子の量で、大きな細胞集団1-3内の細胞間の差異を明らかにした。これらの不均一性は、細胞適応と進化9根本的に重要であるが、また、例えば10-13癌などの疾患の出現および治療 に重要な役割を果たすと考えられている。したがって、単一細胞レベルでの研究は、これらの研究は、生物活性化学物質を用いた治療後の異なる細胞応答を明らかにする場合は特に、生物学的および薬理学的研究において高い関心が持たれている。
近年では、多くの分析プラットフォームは、単一の生細胞の分析または細胞内容物の化学組成を容易に開発されている。蛍光活性化細胞選別（FACS）がゴールドSTですがandard単一の生細胞の非常にハイスループット分析のために、この方法は、細胞内または分泌された化合物の定量に用いることができない。マイクロ流体プラットフォームの出現は、単セルの配置、治療および観察のための新規な分析的な戦略を約束した。マイクロ流体中のマイルストーンはクエイクや同僚14,15によって実現フレキシブルなPDMSバルブの統合に達した。これらのバルブは、彼らは例えば、二つの文化16を分離、チップ上の領域を分離することができるので便利です。さらに、それらは、単一細胞解析に特に適用可能であり、したがって、検体の希釈の問題を低減するのに役立つ。単一細胞分析のためのこのアプローチの電力は、最近ハンセンと平行な17の単一の細胞から数百の遺伝子発現を分析した共同研究者によって実証されている。
タンパク質および代謝産物を標的とする場合、分析は、適切なαの欠如のために非常に困難であるmplification方法、様々な本発明の化合物、および化学的性質におけるそのバリエーション多数。さらに、ほとんどの細胞内生体分子は、従って使用される分析方法は、高い感度を持っている必要があり、数千、数10 18のために、低コピー数で存在することが予想される。そのようなイムノアッセイおよび酵素結合免疫測定法（ELISA）のようなより強力なアッセイは、それらがいくつかの洗浄およびインキュベーション工程、ならびに表面固定化を必要とするため、マイクロ流体デバイスに統合することが困難である。
これらの課題に起因し、それは、タンパク質または代謝産物が単一細胞レベルで定量したところ、わずか数例が報告されていることは驚くべきことではない。例えば、蛍光化合物の分泌の研究は19,20が報告されている。近年、ELISAによる実装は、細胞培養物から分泌された（非蛍光）、タンパク質（THP-1細胞）の分析21と、単一の（iについて提示されたmmune）細胞10。細胞内タンパク質を標的とする、市らは、イムノアッセイ11によって腫瘍細胞におけるシグナル伝達経路の解析のための細胞内タンパク質の同定を容易にするマイクロ流体デバイスを開発した。しかし、タンパク質の相対量のみを測定し、まだ酵素的増幅は、低存在量タンパク質に対するシグナルを増加させるために使用されなかった。
最近では、蛍光アッセイ8とイムノアッセイ22（ 図1）とのシングルセルトラップマイクロデバイスを結合することができました。細胞を受動的に供給し、細胞のあらゆる動きのない媒体および他の化学物質の（急速）の交換を可能にするマイクロサイズハードル構造にトラップされる。各トラップの周囲にリング状の弁は、非常に少量（「マイクロチャンバー」）で、細胞を単離することができます。この弁は、彼、細胞溶解（低浸透圧）のバッファを導入した直後に作動するNCE離れて拡散する細胞内分子または分泌される分子を防止することができる。最も重要なことに起因する体積（plの625）のサイズが小さい分子の大きな希釈が回避される。溶解および分析は、チップの同じ位置で行われるので、輸送に起因する分析物の損失はない。ここに記載のチップ設計は、60マイクロチャンバー合計7または8のいずれかのマイクロチャンバ8の交互の行を含む。線に沿った相互汚染が排除されるように、チャンバは、列に作動される。
プラットフォームは、蛍光アッセイ、ならびに免疫学的ア ッセイ（ 図1d）と組み合わせて使用することができる。後者に関しては、チップ製造および組立工程と適合性である抗体の固定化のためのプロトコルを確立した。したがって、プラットフォームは、単一細胞レベルで、信頼性の高い感受性および定量化アッセイのための道を開く。これまで、我々は、iの分析のために装置を使用しているntracellularと分泌される酵素（酵素アッセイによる相対定量化）、細胞内の補因子、タンパク質と小分子（エンドポイントアッセイやELISAによる絶対定量）。以下では、マイクロコンタクト·プリンティングおよび界面化学を用いて多層ソフトリソグラフィーおよび抗体のパターニングのためのプロトコルを用いて、チップ製造プロセスを説明。さらに、チップの使用および操作のいくつかの例が示されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
マイクロフルイディクス技術は、単一細胞分析のための新しい魅力的な可能性を開いた。具体的には、トラップする可能性と、マイクロ流体ツールで個別に細胞を固定は、単一セルのプロパティと対応に関する体系的な短期的および長期的な研究を可能にした。また、マイクロチップ上に発生した高周波微小液滴、中の細胞のカプセル化は、従来のフローサイトメトリー装置を用いて実施す?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者は感謝して特注の圧力制御システムの構築のために原稿の校正のためのトム·ロビンソン、C.BärtschiおよびH.ベンツを認める。我々はまた、両方のスイス連邦工科大学チューリッヒ、クリーンルーム施設FIRST光学顕微鏡センター（LMC）の使用を承認したいと思います。作業は第7次フレームワークプログラム（ERCの開始グラント、プロジェクト番号203428、nμLIPIDs）の下でメルクセローノと欧州研究会議（ERC）によって賄われていた。
Materials
| REAGENTS: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | n.a. | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane | ABCR (Karlsruhe, Germany) | AB103608 | |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| AZ 726 developer | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A-4503 | |
| Bovine serum albumin, biotin | Sigma Aldrich | A-8549 | |
| Cell dissociation buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Hexamethyldisilazane (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| Hydrochloric acid | Fluka | 84422 | |
| Isopropanol | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fluka | 63068 | |
| MR developer 600 | Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) | n.a. | |
| PBS | Invitrogen | 10010-031 | |
| PLL-g-PEG grafted | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| PLL-g-PEG grafted biotin | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| Potassium chloride | Fluka | 60132 | |
| Protein G, biotin | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| Silicon wafer | Si-Mat (Kaufering, Germany) | n.a. | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | 1610716 | |
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| 0.22 µm PES syringe filter | TRP | 99722 | |
| 1/1.5 mm biopsy puncher | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Cell Trics filter 20 µm | Partec | 04-004-2325 | |
| Centrifuge Sigma 3-18K | Kuehner | n.a. | |
| Hotplate HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| MA-6 mask aligner | Karl Suess | n.a. | |
| Multizoom AZ100M microscope | Nikon Corporation | n.a. | |
| Photomask | Microlitho, Essex, U.K. | n.a | |
| Plasma Cleaner PDC-32G | Harrick | n.a. | |
| Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a. | |
| Spin Modules SM 180 BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| Step profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a. | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni | n.a. |
Referenzen
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