Un saggio di migrazione cellulare quantitativa per murini enterici neurali Progenitori
Summary
Presentiamo un ex vivo delle cellule saggio di migrazione che permette una precisa quantificazione della enterico potenziale migrazione delle cellule della cresta neurale in presenza di vari fattori di crescita.
Abstract
Cellule della cresta neurale (NCC) sono una popolazione transitoria e multipotenti cellule che proviene dal tubo neurale dorsale e migra ampiamente in tutto il vertebrato sviluppo dell'embrione. Oltre a fornire glia e neuroni periferici, NCC generare melanociti nonché la maggior parte dello scheletro cranio-facciale. Migrazione NCC e la differenziazione è controllata da una combinazione della loro origine assiale lungo il tubo neurale e la loro esposizione ai segnali extracellulari regionale distinti. Tale contributo di ligandi extracellulari è particolarmente evidente durante la formazione del sistema nervoso enterico (ENS), una complessa rete interconnessa di gangli neurale che controlla localmente (tra le altre cose) movimento intestinale muscolare e la motilità intestinale. La maggior parte della ENS è derivato da una piccola piscina iniziale di NCC che intraprendere un lungo viaggio per colonizzare – in un rostrale alla moda caudale – l'intera lunghezza del futuro dell'intestino. Tra le varie vie di segnalazione noti perinfluenza enterico colonizzazione NCC, GDNF segnalazione / RET è riconosciuto come il più importante. Infatti, la secrezione controllata spatiotemporally della RET ligando GDNF dal mesenchima intestino è principalmente responsabile per l'attrazione e la guida di-RET esprimere enterico NCC da e all'interno dell'intestino embrionale. Qui, descriviamo un ex vivo saggio migrazione cellulare, facendo uso di una linea di topi transgenici in possesso fluorescente NCC, che permette una precisa quantificazione della enterico potenziale migrazione NCC in presenza di vari fattori di crescita, tra GDNF.
Introduction
Cellule della cresta neurale (NCC) sono un tipo di cellula transitoria unica di vertebrati che si forma molti derivati durante lo sviluppo embrionale. Questa popolazione di cellule si pone al confine della placca neurale, adiacente al ectoderma non-neurale 1. Durante neurulazione, piegatura dei luoghi placca neurale NCC lungo il bordo dorsale del tubo neurale formatura. NCC poi subire una transizione epitelio-mesenchimale, segregazione e la migrazione dal tubo neurale. NCC colonizzare varie strutture embrionali compresi il tratto digestivo dove formano l'intero sistema nervoso enterico (ENS), una rete interconnessa di gangli nervosi incorporato nella parete intestinale. Come recentemente rivisto 2,3, molti geni sono stati coinvolti nello sviluppo di questa intricata struttura.
La maggior parte della ENS è derivato da una piccola piscina di NCC provenienti dal tubo neurale vagale (ossia circa il limite prospettico hindbrain / midollo spinale) 4.Questi progenitori neurali raggiungono il foregut intorno al giorno embrionale (e) 9.0 nei topi e poi migrano caudale all'interno del mesenchima intestino fino a circa e15.0 a colonizzare l'intero intestino embrionali. Un sottoinsieme minore di progenitori neurali colon è fornito anche da sacrale NCC, che invadono l'intestino posteriore in direzione opposta fino al cieco 4. Sia vagale e sacrale NCC richiedere più migrazione, proliferazione, sopravvivenza e spunti-differenziazione promuovere per garantire la formazione completa della ENS. A questo proposito, i modelli animali – topi geneticamente modificati, in particolare – sono state fondamentali per l'identificazione dei vari ligandi extracellulari essenziali: GDNF (glial cellule fattore neurotrofico derivato), dell'endotelina-3, neurotrofina-3, (proteine morfogenetiche dell'osso) BMP, Netrin , così come Sonic e indiano Hedgehog (Shh e Ihh) 5-10. Di questi, GDNF segnalazione attraverso il RET recettore transmembrana tirosin chinasi (Risistemato durante la transfezione), è riconosciuto come esimoe percorso più critico per l'attrazione e la guida di NCC da e all'interno dell'intestino embrionale. GDNF è secreto dal mesenchima intestino e forma un gradiente rosrrocaudal controllato spatiotemporally che è direttamente chemoattractive a enterico NCC, che esprimono RET 11,12.
Fra le altre funzioni, l'ENS regola il movimento all'interno del tubo digerente attraverso la sua interazione con la muscolatura liscia della parete intestinale. Assenza di gangli nervosi nella regione terminale dei risultati intestinali nella malattia di Hirschsprung: contrazione tonica del segmento interessato conduce al blocco, l'accumulo a monte del materiale digerito e massiccia distensione dell'intestino e dell'addome. La malattia di Hirschsprung si verifica circa uno su 5.000 nati vivi. Il modello migratorio rostro-caudale enterico NCC si crede di essere il principale fattore che contribuisce alla eziologia della malattia di Hirschsprung. Il colon, più lontana dalla fonte di migrazione NCC e ultima porzione di bowel ad essere colonizzato, è più suscettibile a difetti nella formazione ENS. In conformità con il suo ruolo cruciale nella migrazione enterico NCC, interruzione del segnale GDNF / RET è la principale causa conosciuta genetica della malattia di Hirschsprung 13.
Per studiare meglio NCC e sviluppo ENS, abbiamo generato una linea di topi transgenici – chiamato Gata4p [5kb]-GFP 14 – in cui migratori NCC sono etichettati con la Green Fluorescent Protein (GFP). Abbiamo poi messo a punto un saggio ex vivo migrazione cellulare, adattato dal lavoro pubblicato da altri gruppi 11,12,15, che ora consente una precisa quantificazione della enterico potenziale migrazione NCC in presenza di vari fattori di crescita, quali GDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mostriamo come il nostro ex vivo espianto cultura tecnica può essere utilizzata per quantificare con precisione enterico migrazione potenziale NCC in presenza di GDNF. Tale quantificazione precisa è notevolmente semplificata ricorrendo a 200 micron di spessore sezioni vibratome budello invece di grandi pezzi di dimensioni approssimative, come descritto in precedenza 11,12,15. In effetti, questo ci permette di lavorare con un numero ragionevole di cellule in un ambiente altamente riproducibile. Da n…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Denis Flipo per consigli elaborazione delle immagini e analisi, e David W. Silversides nel cui laboratorio è stata generata la linea di topi Gata4p [5kb]-GFP. La ricerca in laboratorio Pilon è finanziato dal CIHR, NSERC, FRQS e FRQNT.
Materials
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 |
Referenzen
- Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung’s disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
- Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
- Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
- Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
- Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
- Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
- Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
- Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
- Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
- Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
- Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
- Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).
