Um ensaio de migração celular quantitativo para murinos progenitores neurais entéricas
Summary
Apresenta-se um ensaio de migração de células ex vivo que permite a quantificação precisa do potencial de migração de células de crista neural entérico na presença de vários factores de crescimento.
Abstract
Células da crista neural (NCC) é uma população de células multipotentes transitória e que se origina a partir do tubo neural dorsal e migra extensivamente em todo o embrião de vertebrados em desenvolvimento. Além de proporcionar a glia e os neurónios periféricos, NCC gerar melanócitos, bem como a maior parte do esqueleto crânio-faciais. A migração e diferenciação NCC é controlada por uma combinação da sua origem axial ao longo do tubo neural e sua exposição a estímulos extracelulares regionalmente distintas. Tal contribuição de ligandos extracelulares é especialmente evidente durante a formação do sistema nervoso entérico (ENS), uma rede de complexo interligado de gânglios neurais que controla localmente (entre outras coisas) o movimento do músculo do intestino e motilidade intestinal. A maior parte do ENS é derivado a partir de um pequeno conjunto inicial de NCC que empreender um longo percurso, a fim de colonizar – num rostral para caudal moda – todo o comprimento do intestino prospectivo. Entre as várias vias de sinalização conhecidosinfluenciar colonização NCC entérico, GDNF / sinalização RET é reconhecido como o mais importante. Na verdade, a secreção de espaço-temporalmente controlada do RET ligante GDNF pelo mesênquima intestino é o principal responsável para a atração e orientação de expressar-RET entérico NCC para e dentro do intestino embrionário. Aqui, nós descrevemos um ensaio ex vivo, a migração de células, fazendo uso de uma linha de ratinho transgénico possuindo marcado por fluorescência NCC, que permite a quantificação precisa do potencial de migração entérico NCC na presença de vários factores de crescimento, incluindo o GDNF.
Introduction
Células da crista neural (NCC) são um tipo de célula transitória única de vertebrados que forma muitos derivados durante o desenvolvimento do embrião. Esta população de células surge na fronteira da placa neural, ao lado ectoderma não-neural 1. Durante neurulação, curvatura da placa neural NCC lugares ao longo do bordo dorsal do tubo neural formando. NCC então sofrer uma transição epitelial-mesenquimal, segregar e migrar para longe do tubo neural. NCC colonizar várias estruturas embrionárias, incluindo o tracto digestivo onde formam todo o sistema nervoso entérico (ENS), uma rede interligada de gânglios neurais embutido na parede do intestino. Como recentemente revisou de 2,3, muitos genes foram envolvidos no desenvolvimento desta estrutura intrincada.
A maior parte do ENS é derivado de uma pequena piscina de NCC proveniente do tubo neural vagal (ou seja, em torno do potencial limite rombencéfalo / medula espinal) 4.Estes progenitores neurais chegar ao intestino anterior em torno do dia embrionário (e) 9,0 em ratos e depois migrar caudalmente dentro do mesênquima intestino até aproximadamente e15.0 para colonizar todo o intestino embrionárias. Um subconjunto menor de células progenitoras neurais cólon também é fornecida por sacral NCC, que invadem o intestino posterior na direcção oposta até ao ceco 4. Ambos vagal e sacral NCC requerem múltiplos migração, proliferação, sobrevivência e-sinais de promoção de diferenciação para garantir a formação completa do ENS. A este respeito, os modelos animais – especialmente ratos geneticamente modificados – têm sido fundamentais para a identificação de vários ligandos extracelulares essenciais: GDNF (factor neurotrófico derivado de células gliais),,, (proteínas morfogenéticas do osso) BMPs neurotrofina-3 endotelina-3, Netrin , assim como Sonic e indiano Hedgehog (Shh e Ihh) 5-10. Destes, o GDNF a sinalização através de RET receptor transmembranar da tirosina quinase (Rearranged durante a transfecção), é reconhecido como the caminho mais crítico para a atração e orientação do NCC e para dentro do intestino embrionário. O GDNF é secretada pelo mesênquima intestino e forma um gradiente rosrrocaudal espaço-temporalmente controlado, que é directamente quimioatratante para entérico NCC, que expressam RET 11,12.
Entre outras funções, o ENS regula o movimento no interior do tracto digestivo através da sua interacção com o músculo liso na parede intestinal. Ausência de gânglios neural na região terminal dos resultados intestinais na doença de Hirschsprung: a contração tônica do segmento afetado leva ao bloqueio, a acumulação a montante do material digerido e distensão maciça do intestino e abdômen. Doença de Hirschsprung ocorre cerca de um em 5.000 nascidos vivos. O padrão de migração rostro-caudal de entérico NCC é acreditado para ser o principal fator de contribuição à etiologia da doença de Hirschsprung. O cólon, mais afastada da fonte de migrar NCC e última porção de bowel a ser colonizada, é mais suscetível a defeitos na formação ENS. De acordo com o seu papel crucial na migração NCC entérico, a interrupção da sinalização GDNF / RET é a principal causa genética conhecida da doença de Hirschsprung 13.
Para melhor estudar NCC e desenvolvimento ENS, geramos uma linha de camundongo transgênico – chamado Gata4p [5kb]-GFP 14 – em que migratório NCC são rotulados com Proteína Fluorescente Verde (GFP). A seguir, aperfeiçoou um ensaio ex vivo, a migração celular, adaptado a partir de trabalhos publicados por outros grupos 11,12,15, que agora permite a quantificação precisa do potencial de migração entérico NCC na presença de vários factores de crescimento, tais como o GDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós mostramos como nosso ex vivo explante técnica de cultura pode ser usada para quantificar com precisão entérico potencial de migração NCC na presença de GDNF. Essa quantificação precisa é muito facilitada usando 200 seções vibratome intestino m de espessura em vez de grandes pedaços de tamanho aproximado, como descrito anteriormente 11,12,15. Na verdade, isso nos permite trabalhar com um número razoável de células em um ambiente altamente reprodutível. De nota, a distribuição un…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Denis Flipo para o conselho de processamento e análise de imagem, e David W. Silversides em cujo laboratório a linha de rato Gata4p [5kb]-GFP foi gerada. Pesquisas em laboratório Pilon é financiado pelo CIHR, NSERC, FRQS e FRQNT.
Materials
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 |
Referenzen
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