Generazione di Shear Adesione mappa usando SynVivo reti microvascolari sintetico
Summary
Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.
Abstract
Saggi di adesione cellulare / particelle sono fondamentali per comprendere le interazioni biochimiche coinvolte nella patofisiologia della malattia e avere importanti applicazioni nella ricerca per lo sviluppo di nuove terapie. I saggi che utilizzano condizioni statiche riescono a catturare la dipendenza di adesione su taglio, limitando la loro correlazione con l'ambiente in vivo. Camere di flusso piastra paralleli che quantificano l'adesione sotto il flusso del fluido fisiologico bisogno di più esperimenti per la generazione di una mappa adesione taglio. Inoltre, essi non rappresentano la scala in vivo e morfologia e richiedono grandi volumi (~ ml) di reagenti per esperimenti. In questo studio, abbiamo dimostrato la generazione di taglio mappa adesione da un singolo esperimento utilizzando una rete microvascolare basata dispositivo microfluidica, SynVivo-SMN. Questo dispositivo ricrea il complesso sistema vascolare vivo tra cui scala geometrica, elementi morfologici, le caratteristiche dei flussi e le interazioni cellulari in unformato in vitro, fornendo in tal modo un ambiente biologicamente realistico per ricerca di base e applicata nel comportamento cellulare, la consegna della droga, e la scoperta della droga. Il saggio è stato dimostrato studiando l'interazione dei 2 micron particelle biotina-avidina rivestite con superfici rivestite del microchip. L'intera gamma di taglio osservata nel microcircolo è ottenuta in un singolo saggio consenta adesione vs shear mappa per le particelle in condizioni fisiologiche.
Introduction
Saggi attuali studiare per cellula-cellula e cellula-interazioni delle particelle tipicamente comportano statica formato pozzetti in cui le particelle o le cellule vengono incubate su matrici proteiche o cellule aderenti. Al termine del tempo di incubazione specificato, il numero di particelle aderenti o cellule vengono quantificati mediante microscopia 1. Anche se questi test forniscono informazioni significative sui processi biochimici che stanno dietro queste interazioni, una limitazione fondamentale è la mancanza di flusso del fluido fisiologico (tipico del microcircolo) e il suo impatto sulla adesione delle particelle.
Per superare questa limitazione, camere di flusso in vitro sono stati sviluppati negli ultimi anni. Un elemento comune di queste camere di flusso è un apparecchio trasparente perfusione a bassi numeri di Reynolds per abbinare i tassi di taglio della parete osservati nei vasi sanguigni in vivo 2. La parete del serbatoio è modellato da uno strato di biomolecole o crescita di cellule su una superficie del flusso cHamber 3. Particelle 4-7 o 8-16 cellule vengono poi scorreva dentro al campo desiderato di portate di quantificare il numero di aderire particelle sotto vari gradienti di velocità.
Tuttavia, l'utilizzo di camere di flusso piastra paralleli per studiare e validare i fenomeni biochimici è piuttosto costoso e richiede tempo. Ciò è dovuto principalmente al fatto che esperimenti multipli devono essere realizzati per generare una mappa della fluidico taglio rispetto al numero di particelle / cellule aderito. Inoltre, camere di flusso piastra richiedono grandi volumi di reagenti causa delle loro grandi dimensioni (altezza> 250 micron e larghezza> 1 mm). Infine, questi dispositivi non modellare accuratamente caratteristiche geometriche (ad esempio, biforcazioni) e condizioni di flusso (ad esempio, convergenti vs divergenti flussi) che sono presenti in vivo.
I recenti progressi nella litografia basata microfabbricazione 17-19 hanno accelerato il campo di lab-on-a-chipdispositivi di 20-21. Questi dispositivi hanno contribuito a sviluppare una versione miniaturizzata della camera di flusso a piatti paralleli con dimensioni in regime micrometro. La riduzione di dimensione produce anche vantaggi significativi in termini di volumi di reagenti, cellule o particelle richiesta per esperimenti. Tuttavia, una limitazione chiave dei dispositivi attualmente disponibili è l'uso di canali lineari per modellare microvasi, che non imitano il complesso microcircolo osservato in vivo.
Abbiamo recentemente sviluppato una nuova metodologia per ricreare le reti microvascolari su substrati di plastica usa e getta con conseguente rappresentazione sintetica delle condizioni in vivo. Questi dispositivi chiamati reti microvascolari SynVivo-sintetiche (SMN), sono sviluppate utilizzando PDMS basate processo soft-litografia. Dispositivi SynVivo-SMN possono essere utilizzati per ottenere shear mappa adesione di cellule / particella adesione 22, studio mirato consegna della droga 23 e have stato validato con i dati in vivo 24-25. In questo articolo, vi presentiamo un protocollo che consente la generazione della mappa di adesione al taglio da un singolo esperimento in volumi piccoli come 1-5 microlitri un conseguente notevole risparmio di risorse e di tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Camere di flusso piastra paralleli, fornendo spunti significativi in interazioni cellula-cellula e cellula-particelle, soffrono di alcune limitazioni quali elevato consumo di reagenti e la necessità di molteplici prove sperimentali di generare una mappa adesione taglio. L'uso delle reti microvascolari SynVivo-sintetiche (SynVivo-SMNs) consente la generazione di una mappa di adesione al taglio da un singolo esperimento in condizioni che mimano le condizioni in vivo. Inoltre, si ottiene anche un rispar…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La tecnologia SynVivo è stato sviluppato sotto concessione # 2R44HL076034 dal NHLBI.
Materials
| SynVivo-SMN | CFD Research | SMN-001 | Exclusive at CFDRC |
| CFD-ACE+ | ESI Inc. | N/A | |
| Avidin | Invitrogen | 43-4401 | Any avidin source will work for this assay |
| Biotinylated Particles | Polysciences | 24173-1 | Any source of biotinylated particles will work for the assay |
| Tygon Tubing | VWR | 63018-044 | Size is typical for use with SynVivo-SMN |
| NIKON Elements | NIKON Instruments | N/A | Any other imaging software can be used |
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