Geração de cisalhamento Adesão Mapa Usando SynVivo Networks microvasculares sintético
Summary
Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.
Abstract
Ensaios de adesão celular / partículas são fundamentais para a compreensão das interações bioquímicas envolvidas na fisiopatologia da doença e têm aplicações importantes na busca pelo desenvolvimento de novas terapias. Os ensaios com condições estáticas não conseguem captar a dependência da adesão em cisalhamento, limitando a sua correlação com o ambiente in vivo. Câmaras de fluxo de placas paralelas que quantificam a adesão sob fluxo de fluido fisiológico precisar de vários experimentos para a geração de um mapa de adesão ao cisalhamento. Além disso, elas não representam a escala in vivo e morfologia e requerem grandes volumes (~ ml) de reagentes para os experimentos. Neste estudo, demonstramos a geração de mapa de adesão ao cisalhamento de um único experimento usando uma rede microvascular baseado dispositivo micro, SynVivo-SMN. Este dispositivo recria o complexo na vasculatura vivo incluindo escala geométrica, elementos morfológicos, as características de fluxo e interações celulares em umin vitro formato, proporcionando assim um ambiente biologicamente realista para pesquisa básica e aplicada no comportamento celular, distribuição de medicamentos, e descoberta de drogas. O ensaio foi demonstrada pelo estudo da interacção das partículas de 2 um revestido com biotina com as superfícies revestidas com avidina da microplaca. A gama inteira de corte observada na microvasculatura é obtido com um único ensaio permitindo adesão versus mapa de cisalhamento para as partículas sob condições fisiológicas.
Introduction
Os ensaios correntes para estudar a célula-célula e as interacções célula-partículas tipicamente envolvem formato bem prato estático, em que as partículas ou as células são incubadas em matrizes de proteínas ou células aderentes. No final do tempo de incubação específico, o número de partículas aderentes ou células são quantificados usando microscopia 1. Mesmo que estes ensaios fornecem um panorama significativo para os processos bioquímicos por trás dessas interações, uma limitação importante é a falta de fluxo de fluido fisiológico (típico da microcirculação) e seu impacto sobre a adesão de partículas.
Para superar esta limitação, na câmara de fluxo in vitro têm sido desenvolvidos nos últimos anos. Um elemento comum destas câmaras de fluxo é um aparelho transparente perfundidos a baixo número de Reynolds para combinar taxas de cisalhamento de parede observadas nos vasos sanguíneos in vivo 2. A parede do vaso é modelado por qualquer revestimento de biomoléculas ou crescimento de células numa superfície do fluxo cHamber 3. Partículas 4-7 ou células 8-16 são então fluiu na faixa desejada de taxas de fluxo para quantificar o número de aderir partículas sob várias taxas de cisalhamento.
No entanto, a utilização de câmaras de fluxo de placa paralelas para estudar e validar os fenómenos bioquímicos é bastante dispendioso e moroso. Isto é principalmente devido ao fato de que as múltiplas experiências devem ser conduzidas para gerar um mapa de cisalhamento de fluidos em relação ao número de partículas / células aderidas. Além disso, as câmaras de fluxo de placa requerem grandes volumes de reagentes, devido ao seu grande tamanho (altura> 250 um e largura de> 1 mm),. Finalmente, estes dispositivos não modelar de forma precisa (por exemplo, características geométricas, bifurcações) e as condições de fluxo (por exemplo, contra os fluxos divergentes convergentes) que estão presentes in vivo.
Os recentes avanços na litografia baseada microfabricação 17-19 aceleraram o campo de lab-on-a-chipdispositivos 20-21. Estes dispositivos têm sido fundamentais para o desenvolvimento de uma versão em miniatura da câmara de fluxo de placas paralelas com dimensões no regime micrômetro. A redução da dimensão também produz benefícios significativos em termos de volumes de reagentes, células ou partículas necessária para os experimentos. No entanto, uma limitação chave dos dispositivos actualmente disponíveis é a utilização de canais lineares para modelar microvasos, que não mimetizam a microvasculatura complexo observada in vivo.
Recentemente, desenvolveu uma nova metodologia para a recriação de redes microvasculares sobre substratos de plástico descartáveis, resultando em representação sintética das condições in vivo. Estes dispositivos denominado Redes microvasculares SynVivo-sintéticos (SMN) são desenvolvidos utilizando PDMS processo soft-litografia baseia. Dispositivos SynVivo-SMN pode ser usado para obter mapa de adesão ao cisalhamento de celular / partícula adesão 22, o estudo direcionado a entrega da droga e 23 have foi validado contra dados in vivo 24-25. Neste artigo, apresentamos um protocolo que permite a geração do mapa de adesão ao cisalhamento de um único experimento em volumes tão pequenos quanto 1-5 mL, assim, resultando em significativa economia de recursos e tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Câmaras de fluxo de placas paralelas, proporcionando insights significativos sobre as interacções célula-célula e célula-partículas, sofrem de várias limitações, tais como o elevado consumo de reagentes e a necessidade de vários ensaios experimentais para gerar um mapa de adesão de cisalhamento. O uso de redes microvasculares SynVivo-sintéticos (SynVivo-SMNs) permite a geração de um mapa de adesão ao cisalhamento de um único experimento em condições que imitam as condições in vivo. Além di…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tecnologia SynVivo foi desenvolvido sob concessão # 2R44HL076034 do NHLBI.
Materials
| SynVivo-SMN | CFD Research | SMN-001 | Exclusive at CFDRC |
| CFD-ACE+ | ESI Inc. | N/A | |
| Avidin | Invitrogen | 43-4401 | Any avidin source will work for this assay |
| Biotinylated Particles | Polysciences | 24173-1 | Any source of biotinylated particles will work for the assay |
| Tygon Tubing | VWR | 63018-044 | Size is typical for use with SynVivo-SMN |
| NIKON Elements | NIKON Instruments | N/A | Any other imaging software can be used |
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