Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bottom-up og Shotgun Proteomikk å identifisere en omfattende Cochlea Proteome

Published: March 7, 2014 doi: 10.3791/51186
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Summary

Proteom analyse av cochlea sensorisk epitel kan være utfordrende på grunn av sin lille størrelse og fordi membran proteiner er vanskelige å isolere og identifisere. Både membran og oppløselige proteiner kan identifiseres ved å kombinere flere preparative metoder og separasjonsteknikker sammen med høy-oppløsningsmassespektroskopi.

Abstract

Proteomikk er en vanlig brukt metode som kan gi innsikt i komplekse biologiske systemer. Den cochlea sensorisk epitel inneholder reseptorer som transduce den mekaniske energien til lyd i en elektro-kjemisk energi som behandles av det perifere og sentrale nervesystem. Flere proteomic teknikker har blitt utviklet for å studere cochlea indre øret, slik som to-dimensjonale forskjell gelelektroforese (2D-DIGE), antistoff microarray, og massespektrometri (MS). MS er den mest omfattende og allsidig verktøy i proteomikk og i forbindelse med separasjonsmetoder kan gi en grundig proteomet av biologiske prøver. Separasjons metoder kombinert med MS har evnen til å berike proteinprøver, detektere lav molekylvekt og hydrofobe proteiner, og identifisere lave tallrike proteiner ved å redusere proteomet dynamisk område. Forskjellige fordøyelse strategier kan bli anvendt for å hel-lysat eller fraksjonert protein lysatet for å øke peptid-og proteinsekvens dekning. Utnyttelse av forskjellige separasjonsteknikker, inkludert sterk kationbytter (SCX), reversfase (RP), og gel-eluert væskefraksjon innesperring elektroforese (GELFrEE) kan anvendes for å redusere kompleksiteten prøven før MS-analyse for protein identifikasjon.

Introduction

Proteomikk er studiet av kompliserte biologiske systemer ved å analysere proteinekspresjon, funksjon, modifikasjoner, og interaksjoner en. Flere metoder er blitt anvendt for proteom analyse av det indre øret, inkludert antistoffer microarray 2, to-dimensjonal gelelektroforese 3-5, og DIGE 6.. Men, har blitt identifisert og karakterisert 2,7-10, sammenlignet med over 10 000 gener og uttrykt sekvens tags (samle såkalte) identifiserte i det indre øret 11,12 bare et begrenset antall proteiner, er MS den mest brukte og omfattende teknikk i proteomikk for protein karakterisering. Analyse av komplekse proteomikk prøver, slik som i sneglehuset, kan være utfordrende. Imidlertid er kombinasjonen av flere separasjonsteknikker med MS muliggjør identifisering av et større antall av peptider og proteiner, på grunn av en økt dynamisk konsentrasjonsområde og maksimal kapasitet 13.. Flerdimensjonal kromatografiPHY reduserer svært komplekse proteinblandinger ved å tillate bruk av forskjellige adsorpsjon mekanismer. Det finnes to vanlige MS proteom analyse tilnærminger, hagle og bottom-up proteomikk. I shotgun proteomforskning, er en blanding av intakte proteiner enzymatisk spaltet og separert ved hjelp av flerdimensjonal kromatografi med sterk kation-byttekromatografi (SCX), etterfulgt av reversfase-væskekromatografi (Bytt ut) 14,15. De separerte peptider er utsatt for tandem MS og databasesøk 15.. En stor fordel med denne teknikken er at tusener av proteiner kan bli identifisert i en enkel analyse, og teknikken er bedre egnet til membranproteiner.

I den opp-ned-metode, blir proteinblandingen separeres, vanligvis ved en-eller todimensjonal elektroforese, og de enkelte proteinbånd eller flekker skåret ut og fordøyd med et enzym slik som trypsin, vanligvis resulterer i flere peptider. Men en annen nyerely utviklet elektro tilnærming, som brukes i bottom-up proteomikk, er GELFrEE. Denne teknikken fraksjonerer proteinprøver i væskefase og gjør dem mindre kompleks før analyse. Denne teknikken er reproduserbar, tilbyr høy protein utvinning, og reduserer fordelingen av høye rikelig proteiner i komplekse proteinprøver 16. Peptides, som følge av separerte proteinene blir analysert ved MS, ved hjelp av peptid-masse fingerprinting eller tandem MS (MS / MS), for å opprette sekvensen koder for database søker 17-19. Noen av de store fordelene med å bruke bottom-up tilnærming er muligheten til å få høyoppløselige separasjoner og omfattende protein dekning. Bottom-up proteomikk er den mest brukte teknikken i proteomikk 20, derav flere bioinformatikk verktøy er tilgjengelige. I tillegg kan proteinene bli separert i en kompleks blanding før fordøyelse, slik at det er større sannsynlighet for identifikasjon.

En av de store utfordringenei å bruke det indre øret for proteomikk analyser er dens liten størrelse, begrenset tilgjengelighet, og celletype mangfold 21. I tillegg er viktige proteiner som skiller dens funksjonalitet, slik som ionekanaler, transportører og reseptorer, er membranproteiner, som kan være vanskelig å isolere 22. Dermed er filter assistert prøveopparbeidelse (FASP) fordelaktig for proteomikk analyser av vev som er begrenset for protein utvinning og som krever vaskemidler til å oppløse membraner 23. Denne filtreringen gjør det mulig for MS-analyse av membran-og oppløselige proteiner, og for evnen til å isolere peptider fra lavmolekylære forurensninger 23,24.

Den nåværende protokollen beskriver brukte proteomikk tilnærminger som er kombinert og modifisering for å analysere både løselig og membran proteiner og å maksimere antallet protein IDer fra cochlea sensorisk epitel. Vi vil beskrive med hagle proteomikk med FASP multi-fordøyeion, ionebytterkromatografi, høy oppløsning MS, og dataanalyse. I tillegg vil vi beskrive bottom-up proteomikk med GELFrEE, FASP multi-fordøyelsen, høyoppløselig MS, og dataanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk Erklæring

Eksperimenter med mus vev ble godkjent av University of South Florida Institutional Animal Care og bruk Committee (Protokoller 3931R, 3482R) som angitt i henhold til retningslinjene av National Institutes of Health.

En. Protein Extraction

  1. Isoler cochlea sensorisk epitel fra 16 30 dager gamle (P30) CBA / J mus og oppbevar ved -80 ° C.
  2. På dagen for eksperimentet, vaskes vevet med 500 ul av 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Sentrifuger for 3 min ved 1000 xg, og fjern supernatanten. Gjenta til totalt tre vaskinger.
  3. Sonicate vev i 30 sekunder på is i 100 ul lyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 120 mM NaCl, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 500 pg / ml AEBSF, 10 ug / ml leupeptin, 100 pg / ml pepstatin, 2 ug / ml aprotinin, og 0,5 pg / ml Microcystin ved hjelp av en sonisk dismembrator (Model 100, Thermo Fisher). Cool lysate på isi 1 min mellom hver sonikator. Sonicate totalt 3x.
  4. Sentrifuger ekstraktet ved 750 x g ved 4 ° C i 2 minutter og fjerne supernatanten til et nytt mikrorør. Ekstraher pelleten i 50 pl av lyseringsbuffer ved sonicating i 30 sekunder på is. Sentrifuger ekstraktet ved 750 x g ved 4 ° C i 2 min. Kombiner begge lysater og sentrifuger ved 28.600 xg ved 4 ° C i 60 min. Fjern supernatanten til et nytt mikrorør og tilsett 20 ul lyseringsbuffer inneholdende 0,1% ASB-14 til pelleten. Vortex i 1 minutt og inkuberes i 60 min ved 4 ° C.
  5. Varm prøven ved 95 ° C i 5 min, deretter avkjøles ved 4 ° C i 60 min. Følg med sentrifugering ved 16.000 xg ved 25 ° C i 10 min. Samle supernatanten og overføre til et nytt rør.
  6. Sentrifuger suspensjonen ved 16.000 x g ved 4 ° C i 5 min og beholde supernatanten for fordøyelsen.

2. Double Tryptisk Protein Fordøyelse av Whole Lysate Bruke FASP

  1. Legg en 30 μl aliquot (≤ 400 pg) av cochlea protein-ekstrakt, inneholdende 4% natrium-dodecyl-sulfat (SDS), 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 og 0,1 M ditiotreitol (DTT) direkte til et 30K spinnfilter og blandes med 200 pl av 8 M urea i Tris-HCl. Sentrifuger ved 14000 x g i 15 min.
  2. Fortynn konsentratet med 200 pl 8 M urea-oppløsning og sentrifuger ved 14 000 xg i 15 min.
  3. Tilsett 10 pl 10x jodacetamid (IAA) i 8 M urea løsningen på konsentratet i filteret og virvle i 1 min. Inkuber sentrifugefilter i 20 minutter ved romtemperatur (RT) i mørket, etterfulgt av sentrifugering ved 14.000 xg i 10 min.
  4. Tilsett 100 pl 8 M urea-løsning til konsentratet på filterenheten og sentrifuger ved 14 000 xg i 15 min. Gjenta dette trinnet 2x. Tilsett 100 pl av 50 mM ammoniumbikarbonat (ABC) oppløsning til filterenheten og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Gjenta dette trinnet 2x.
  5. Til 0,4 mikrogram / mikroliter av trypsin på 1:100 (vekt / vekt) enzym-to-Protein-forhold og inkuberes over natten (O / N) ved 37 ° C.
  6. Etter inkubasjon, tilsett 40 pl av 50 mM ABC-løsning for å filtrere enhet og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Gjenta dette trinnet 1x.
  7. Tilsett 50 pl av 0.5 M NaCl-løsning til spinnfilter og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Overfør filtratet inneholdende de tryptic peptider til en frisk mikrorør og surgjøre med maursyre (FA) til 1,0% for å stoppe fordøyelsen.
  8. Vask filterenhet med 40 pl 8 M urea, og deretter vaske med 2 x 40 mL 18 MΩ vann.
  9. Vask filterenheten 3 x med 100 pl av 50 mM ABC-løsning. Etter den siste vask legg 0,4 mikrogram / mikroliter av trypsin på 1:100 (vekt / vekt) enzym-til-protein-forhold og inkuberes O / N ved 37 ° C.
  10. Eluer tryptic peptider fra den andre fordøye ved å tilsette 40 ul av 50 mM ABC-løsning til filterenheten og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Gjenta dette trinnet 1x.
  11. Tilsett 50 pl av 0.5 M NaCl-løsning tilfilterenhet og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Overfør filtratet inneholdende de tryptic peptider til en frisk mikrorør og surgjøre med FA til 1,0%.
  12. Prøvene kan kvantifiseres ved å bruke mikroplatekolorimetrisk analyse ved bruk av BSA som standard.

Tre. Endoproteinase LysC og Tryptisk Protein Fordøyelse av Whole Lysate Bruke FASP

  1. Legg til en porsjon på 30 pl (≤ 400 pg) av cochlea proteinekstrakt inneholdende 4% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 og 0,1 M DTT direkte til et 30K spinnfilter og blandes med 200 pl 8 M urea i Tris-HCl . Sentrifuger ved 14000 x g i 15 min.
  2. Fortynn konsentratet med 200 pl 8 M urea-oppløsning og sentrifuger ved 14 000 xg i 15 min.
  3. Tilsett 10 pl av 10 x IAA i 8 M urea løsningen på konsentratet i filteret og virvle i 1 min. Inkuber sentrifugefilter i 20 min ved romtemperatur i mørke og deretter sentrifuger ved 14 000 x g i 10 min.
  4. Tilsett 100 pl 8 M urea solution til konsentratet på filterenheten og sentrifuger ved 14 000 xg i 15 min. Gjenta dette trinnet 2x. Tilsett 100 ul av 100 mM ABC-løsning til filterenheten og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Gjenta dette trinnet 2x.
  5. Til 0,1 mikrogram / mikroliter av endoproteinase LysC i en 1:50 (v / v) enzym-til-protein-forhold og inkuberes O / N ved 30 ° C.
  6. Etter inkubasjon, tilsett 40 pl av 100 mM ABC-løsning til filterenheten og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Gjenta dette trinnet 1x.
  7. Tilsett 50 pl av 0.5 M NaCl-løsning til spinnfilter og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Overfør filtratet inneholdende de LysC peptider til en frisk mikrorør og surgjøre med FA til 1,0% for å stoppe fordøyelsen.
  8. Vask filterenhet med 40 pl 8 M urea, og deretter vaske med 2 x 40 mL 18 MΩ vann.
  9. Vask filterenheten 3 x med 100 pl av 50 mM ABC-løsning. Etter den siste vask Tilsett 0,4 mikrogram / mikroliter av trypsin i 1:100 enzym-til-proprotein-forhold og inkuberes O / N ved 37 ° C.
  10. Eluer tryptic peptider ved å tilsette 40 ul av 50 mM ABC-løsning til filterenheten og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Gjenta dette trinnet 1x.
  11. Tilsett 50 pl av 0.5 M NaCl-løsning til filterenheten og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Overfør filtratet inneholdende de tryptic peptider til en frisk mikrorør og surgjøre med 1,0% FA.
  12. Prøven kan kvantifiseres ved å bruke mikroplatekolorimetrisk analyse med BSA som standard.

4. Avsalting peptider ved hjelp av Spin kolonner

  1. Aktiver en C 18 MacroSpin kolonne ved å legge til 500 mL av acetonitril (ACN) og sentrifuger ved 1100 xg i 1 min. Kast gjennomstrømning etter sentrifugering.
  2. Ekvilibrer kolonnen med 500 mL av 0,1% FA og sentrifuger ved 1100 xg i 1 min. Kast gjennomstrømning og gjenta dette trinnet 1x.
  3. Legg opp til 500 mL av peptid fordøye en kolonne tild sentrifuger ved 1100 xg i 1 min. Hvis prøvevolumet er større enn 500 mL deretter gjenta dette trinnet.
  4. Vask kolonnen med 500 mL av 0,1% FA og sentrifuger ved 1100 xg i 1 min. Kast gjennomstrømning. Gjenta dette trinnet 1x.
  5. Til 250 pl av en 90:10 ACN-til-vann-forhold til kolonnen og sentrifuger ved 1100 xg i 1 min. Samle eluenten inneholder avsaltet peptider og overføre til en ny micro. Gjenta dette trinnet 1x.
  6. Tørk avsaltet peptid prøven i en vakuumsentrifuge og unngå å la prøven tørke fullstendig.

5. Ionutvekslingskromatografi

  1. Injiser 50 til 100 mikrogram av fordøyd proteinprøve på en 200 x 2,1 mm, 5 um SCX-kolonne (Polysulfoethyl A) for å separere peptidene.
  2. Bruk av en gradient av 2-40% B over 50 min med en strømningshastighet på 250 mL / min. Oppløsningsmiddel A er 5 mM ammoniumformiat, pH 3,0 i 25% acetonitril og 75% DDH 2 O. Løsemiddel B er 500 mm ammoniumformeat, pH6,0 i 25% ACN og 75% DDH 2 O.
  3. Overvåk peptid fraksjoner ved 280 nm og samle fraksjonene i 2 min intervaller ved hjelp av en fraksjonssamler.
  4. Tørre fraksjoner i et vakuum konsentrator og resuspender i 500 mL 50% acetonitril i DDH 2 O som inneholder 5% FA for å hjelpe til med salt fjerning.
  5. Redry fraksjoner og oppbevar ved -80 ° C til den er klar til bruk for nano LC-MS/MS analyse.

6. Aceton Nedbør

Før GELFrEE separasjon cochlea protein supernatanten må vannes ut. Aceton nedbør kan brukes til å avsalte og konsentrere proteiner.

  1. Legg tre bindene av iskald aceton til cochlea supernatanten. Forsiktig vortex og inkuber ved -20 ° CO / N.
  2. Sentrifuger prøveblanding ved 15.000 xg i 15 min ved 4 ° C, og fjerne supernatanten.
  3. Vask protein pellet 3x med avkjølt aceton og sentrifuger ved 14 000 xg i 5 min ved 4° C.
  4. Lufttørk pellet og oppløses i 112 mL av 18 MΩ vann.
  5. Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av mikrokolorimetrisk assay.

7. GELFrEE fraksjonering av Cochlea Sensorisk Epitel

  1. Tilsett 30 pl av 5 x prøvebuffer (0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w / v) SDS, 50% glyserol, 0,5% (w / v) bromfenol blå) til avsaltet protein suspendert i 112 pl av 18 MΩ vann.
  2. Tilsett 8 pl av 1 M DTT og oppvarmning ved 95 ° C i 5 min for å redusere protein disulfidbindinger. Etter oppvarming tillate avkjøling til romtemperatur.
  3. Tilsett 8 ml av rennende buffer på anodereservoaret, 150 pl rennende buffer prøvetakingen kammeret, og 6 ml av rennende buffer på katoden reservoaret.
  4. Fjern eventuelle buffer som kan ha strømmet inn i prøven-lasterommet ved hjelp av en pipette.
  5. Load 150 mL (≤ 1 mg) av cochlea protein blanding, i prøve-lasterommet ved hjelp av en 8% Trer-acetat kassetten med en masse utvalg av 3,5 til 150 kDa.
  6. Lavere elektroder og nær instrument lokket til å starte løp.
  7. Ved det første Pausetiden på instrumentet tilsett 2 ml av buffer til katoden reservoaret og gjenoppta kjøringen.
  8. På hvert stanset intervall på instrumentet, samle prøven fra prøveinnsamling kammeret ved hjelp av en pipette og legge til en fersk merket micro. Vask samling kammer 2x med 150 mL buffer og kast.
  9. Tilsett 150 ul av frisk buffer til prøvetakingskammeret og gjenoppta kjøringen. Samle proteinfraksjoner over et tidsrom på 2,6 timer i et totalvolum på 150 mL / fraksjon.

8. 1D Gel elektroforese av GELFrEE Brøker

1D gelelektroforese kan bli brukt til å visualisere resultatene fra GELFrEE fraksjonering før enzymatisk fordøyelse og MS-analyse. GELFrEE proteinfraksjonene kan skilles fra hverandre på en 4-15% Tris-HCl-gel.

  • Bland en 5 ul delmengde av hver GELFrEE fraksjon med 5 pl av prøven fortynnende buffer (350 mM DTT i prøvebuffer).
  • Varm opp prøvene ved 95 ° C i 3 min.
  • Kule samples til RT.
  • Load 10 mL av hver GELFrEE fraksjon i enkelt gel baner og last 5 mL av molekylvekt standard i den siste ubrukt kjørefelt.
  • Kjør gelen ved 125 V i 1,5 timer eller inntil fargestoffet fronten har nådd bunnen av gelen.
  • Fjern forsiktig gel og beis med Silver Stain Plus å visualisere protein separasjon.

    • 9. Protein Fordøyelse av GELFrEE Fraksjoner Bruke FASP

    En modifisert FASP fremgangsmåten brukes for å fjerne vaskemiddel og fordøyelse av GELFrEE fraksjoner.

    1. Til hver enkelt fraksjon direkte til en 30 K filterenhet, blandes med 200 pl 8 M urea i Tris-HCl og sentrifuger ved 14 000 xg i 25 min.
    2. Fortynn konsentratet med 200 pl av urealøsningog sentrifuger ved 14 000 xg i 12 min. Gjenta dette trinnet 1x.
    3. Tilsett 10 pl av 10 x IAA i urealøsningen til konsentratet i hver filterenhet, vortex i 1 min, og inkuber i 30 min ved romtemperatur i mørke.
    4. Tilsett 100 ul av urealøsningen til konsentratet i filterenhetene og sentrifuger ved 14 000 xg i 15 min. Gjenta dette trinnet 2x. Tilsett 100 ul av 100 mM ABC-løsning til filterenhetene og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Gjenta dette trinnet 2x.
    5. Til 0,1 mikrogram / mikroliter av LysC for en 1:50 (v / v) enzym-til-protein-forhold til filterenhetene og inkuberes O / N ved 30 ° C.
    6. Etter inkubasjon, tilsett 40 pl av 100 mM ABC-løsning til spinnfilter og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Gjenta dette trinnet 1x.
    7. Tilsett 50 pl av 0.5 M NaCl-løsning til spinnfilter og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Overfør filtratet inneholder LysC peptider fra hvert spinn filter til en frisk micro og forsurer med trifluoroacetic syre (TFA).
    8. Vask spinnfiltre med 40 mL av 8 M urea, vask deretter 2x med 40 mL 18 MΩ vann.
    9. Vask spinn filtrene 3 x med 100 pl av 50 mM ABC-løsning. Etter den siste vask legg 0,4 mikrogram / mikroliter av trypsin i en 1:100 (vekt / vekt) enzym-til-protein-forhold og inkuberes O / N ved 37 ° C.
    10. Eluer tryptic peptider fra hver filterenhet ved å tilsette 40 ul av 50 mM ABC-oppløsning og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Gjenta dette trinnet 1x.
    11. Tilsett 50 pl av 0.5 M NaCl-løsning til filterenhetene og sentrifuger ved 14 000 xg i 10 min. Overfør filtratet inneholdende de tryptic peptider fra hver enkelt filterenhet i en frisk mikrorør og surgjøre med TFA.
    12. Tørk alle fordøyer i en vakuum-konsentrator.

    10. Prøvepreparering for LC-MS/MS

    1. Rekonstituere tørket LysC og tryptiske peptid fordøyer fraksjoner i 20 mL 0,1% FA og virvle.
    2. Sentrifuger prøvene på 20 000 xg for 10min, og fjerne det øverste 95% av prøven til et nytt prøvehetteglass.
    3. Injiser 5 ul av hver peptid-fraksjon på en 100 pm x 25 mm prøve felle for å fjerne salter og forurensninger, og utføre kromatografisk separasjon på en 75 um x 10 cm C-18 kolonne.
    4. Bruk av en gradient av 2-40% B i løpet av 100 min med en strømningshastighet på 200 nl / min. Oppløsningsmiddel A er 95% ddH2O og 5% acetonitril inneholdende 0,1% FA. Løsningsmiddel B er 80% ACN og 20% ​​ddH2O inneholdende 0,1% FA.
    5. Samle ti tandem masse spektra for hver MS skanne på en høyoppløselig massespektrometer. En LTQ Orbitrap massespektrometer ble benyttet i dette forsøk.

    11. Protein Identifikasjon

    1. Identifisere proteiner bruker Uniprot musen database som inneholder både forover og bakover proteinsekvenser og vanlige forurensninger. MaxQuant programvare med MASCOT søkemotor blir brukt til å søke på protein database.
    2. Søkeparametere som kan brukes inkluderer; fast modifiseringasjon av carbamidomethyl av cystein, variable modifikasjoner av oksidasjon av metionin, protein N-terminal acetylering, maksimalt to savnet cleavage. Den minste peptid lengde for å vurdere for identifikasjon er seks aminosyrer. Tast et peptid massekonsentrasjon feil på ± 8 ppm og et fragment masse toleranse på 1,2 Da (mass feil er avhengig av massespektrometer i bruk).
    3. I MaxQuant programvare, bruk en 1% falsk funnraten (FDR) for peptid og protein identifikasjon. Proteinidentifikasjon er oppført med antallet passet peptider, den prosentvise proteinsekvens-dekning, og peptidsekvenser.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    For å få mest mulig dekkende proteomet av cochlea sensorisk epitel, er raskt vev disseksjon nødvendig før protein ekstraksjon og prøveopparbeidelse. To proteomikk teknikker kan brukes, hagle og bottom-up proteomikk. For å fremstille prøver for shotgun proteomforskning ble FASP oppslutningsprosedyre anvendes som illustrert i figur 1.. Den FASP Metoden tillater konsentrasjon av proteiner, fjerning av vaske-og rengjøringsmidler, og fordøyelse av proteiner ved hjelp av flere enzymer. Det var to doble fordøyelse prosedyrer som brukes, den første var en tryptisk fordøyelse etterfulgt av en andre behandling med trypsin, som ble samlet, fraksjonert på en SCX-kolonnen inn i 18 fraksjoner og analysert ved hjelp av nano LC-MS/MS. Totalt 1485 proteiner ble identifisert med en 1% FDR når du utfører en enkelt drevne LC-MS/MS bruke denne eksperimentell tilnærming. Blant de identifiserte proteiner, ble 329 og 258 proteiner kategorisert i mitokondrie-og plasma membran, henholdsvis (figur2A). Den andre dobbel fordøyelse prosedyre besto av LysC fordøyelsen fulgt av trypsin fordøyelsen. Hver digest ble individuelt lastet og separert på SCX kolonne i 18 fraksjoner og analysert av nano LC-MS/MS. Resultatene av LysC og trypsin digestions produserte totalt 3503 proteiner med en 1% FDR. Figur 2B viser at 605 og 617 proteiner ble kategorisert i mitokondrie-og plasma membran, respektivt. Denne tilnærmingen gitt det største antallet av membran-assosiert protein-IDer. Duplikat analyse av LysC og trypsin fraksjoner viste mer enn 65% av proteinene som er identifisert ble delt mellom eksperimentene. Det var imidlertid også nylig identifiserte proteiner i replikere analyse. De ytterligere peptider og proteiner ble identifisert på grunn av små endringer i kromatografi, og derfor fører til forskjellige peptider for fragmentering 25..

    Bottom-up proteomikk ble brukt ved hjelp GELFrEE fraksjonefør LC-MS/MS som illustrert i figur 3.. Det var 12 GELFrEE fraksjoner samlet. Forut for fordøyelse og LC-MS/MS analyse, en sølv-farget gel var klare for å visualisere resultatene fra GELFrEE fraksjone som illustrert i figur 4.. Gelen viste protein separasjon ved å øke molekylvekt for hvert påfølgende brøkdel. Derfor ble de 12 GELFrEE flytende fraksjoner fordøyd ved hjelp av to ulike fler FASP fordøyelsen tilnærminger og analysert av LC-MS/MS. Den første fordøyelsen tilnærming ble utført ved hjelp av en dobbel trypsin fordøyelsen, noe som førte til identifisering av 2165 proteiner med en 1% FDR når du utfører en enkelt-run LC-MS/MS. Figur 5A viser at det var 516 og 399 proteiner kategorisert i mitokondrie og plasma membran, respektivt. Den andre tilnærmingen fordøyelsen ble utført ved bruk av endoproteinase LysC fulgt av trypsin fordøyelsen. Single-run LC-MS/MS analysen identifiserte 2211 proteiner med en 1% FDR. Dettetilnærmingen viser et tilsvarende antall membranassosierte proteiner som ved bruk av trypsin / trypsin tilnærming (figur 5B). De massespektrometri proteomikk data har blitt avsatt til ProteomeXchange Consortium 26 med datasettet identifikator PXD000231 25. Ved å kombinere de resultatene fra de forskjellige teknikker resultert i et stort antall membran og oppløselige proteiner fra mus cochlea sensorisk epitelet (figur 6).

    Figur 1
    Figur 1. Skjematisk av en hagle proteomikk eksperiment ved hjelp FASP, ionebytterkromatografi, og høyoppløselige MS. Proteiner er pakket ut, oppløseliggjort, og fordøyd hjelp FASP med LysC og trypsin endoproteinases. Den LysC (grønn tube) og tryptic peptider (lilla tube) er delt opp i mindre komplekse fraksjoner ved hjelp SCX kromatografi og analysert ved hjelp av nano LC-MS/MS. Maskoten søkemotor ble brukt til å behandle MS data for protein identifikasjon. Klikk her for å se større bilde.

    Fig. 2
    Figur 2. GO cellulære komponenter profil av protein-IDer ved utføring av en (A) første og andre spalting med trypsin, etterfulgt av SCX separasjon og (B) først nedbryting med LysC etterfulgt av en andre behandling med trypsin, etterfulgt av SCX separasjon. Alle kategorier telles nonexclusively, når et protein har mer enn én kategori for cellulære komponenter.es.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

    Figur 3
    Figur 3. Skjematisk av en bottom-up proteomikk eksperiment ved hjelp GELFrEE, FASP, og høy oppløsning MS. Ekstraherte proteiner oppløseliggjøres og proteiner blir utfelt bruker aceton (blå tube) for å fjerne salter og uønskede forurensninger fra lysatet. Proteinet pellet er oppløseliggjort og proteiner fraksjonert ved hjelp GELFrEE. Hver fraksjon ble fordøyd hjelp FASP med LysC og trypsin endoproteinases. Den LysC (grønne rør) og tryptic peptider (lilla rør) fra hver fraksjon er analysert ved hjelp av nano LC-MS/MS og proteiner identifisert ved å søke MS-data ved hjelp av MASCOT. Klikk her for å se stort r image.

    Figur 4
    Figur 4. Sølv-farget gel av cochlea sensoriske epitel GELFrEE fraksjoner, for å visualisere proteinseparasjon i hver fraksjon før MS-analyse. (M) Protein markør, (1) Fraksjon 1, (3) Fraksjon 2, (5) Fraksjon 5, (7) Fraksjon 7 (8) Fraksjon 8, (9) Fraksjon 9, (10) Fraksjon 10, (11) Fraksjon 11, (12) Fraksjon 12. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Darville og Sokolowski 24. Copyright 2013 av American Chemical Society. Klikk her for å se større bilde.

    / Files/ftp_upload/51186/51186fig5.jpg "/>
    Figur 5. GO cellulære komponenter profil av protein-IDer ved utføring av en (A) første og andre behandling med trypsin etter GELFrEE separasjon og (B) først nedbryting med LysC etterfulgt av en andre behandling med trypsin etter GELFrEE separasjon. Alle kategorier telles nonexclusively, når et protein har mer enn én kategori for cellulære komponenter. Klikk her for å se større bilde.

    Figur 6
    Figur 6. GÅ cellulære komponenter profil for alle proteiner er identifisert ved hjelp av SCX, WAX, eller GELFrEE separasjon. Når et protein som hadde mer enn en kategori for cellulære komponenter, er alle dens categories ble talt nonexclusively. Klikk her for å se større bilde.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    De viktigste fremgangsmåten for å maksimere protein identifikasjon av cochlea sensorisk epitel er: 1) bruk av flere endoproteinases for fordøyelsen, 2) bruken av flere separasjonsteknikker, og 3) bruk av en høy-oppløsnings masse-spektrometer. Anvendelsen av flere enzymer øker antallet peptider og forbedrer proteinsekvens dekning, og dermed øke antall identifiserte proteiner fra sneglehuset vev. Trypsin, den mest brukte protease gir effektiv og spesifikk spalting av proteiner, genererer peptider som er bra for MS ionisering og fragmentering. Imidlertid, ved hjelp av et annet enzym før trypsin, slik som LysC, som også spalter på lysinresten, gir mer effektiv peptid spalting. Det ble observert at sekvensen dekning av proteinene som genereres fra LysC / trypsin fordøyelse viste en økning i proteinsekvensen dekning i forhold til proteinsekvens dekning fra trypsin / trypsin digest.

    ove_content "> Implementering av flerdimensjonal separasjon før MS reduserte høy cochlea prøven kompleksiteten i hagle proteomikk tilnærming. Dette åpnet for identifisering av flere proteiner, inkludert membran proteiner, som er typisk vanskelig å identifisere. ble funnet et større antall membran proteiner ved hjelp hagle metode i motsetning til den opp-ned-metode. imidlertid. Dette er en opp-ned-metode ved hjelp av GELFrEE tillatt for identifikasjon av flere lave tallrike proteiner på grunn av isoleringen av høyere tallrike proteiner, slik som cochlin fra sneglehuset, inn i individet fraksjoner.

    De data av høy kvalitet som er oppnådd i denne protokoll av en høyoppløselig massespektrometer, som for eksempel en LTQ-Orbitrap, forbedrer og øker antall proteiner som kan identifiseres i sneglehuset. Den LTQ-Orbitrap tilbyr høy oppløsning, høy masse nøyaktighet, og høy følsomhet for analyse av peptider. Derfor er anvendelsen av dette instrument enables identifisering av proteiner fra komplekse biologiske prøver, slik som cochlea sensorisk epitel og forbedrer identifisering lave tallrike peptider. Utnyttelse av disse kombinerte eksperimentelle tilnærminger med den kraftige verktøy for MS bidrar til en betydelig økning i cochlea protein datasett, derfor bedre mulighet til å identifisere nye biomarkører som er involvert i å høre og døvhet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

    Acknowledgments

    Forfatterne takker Dr. Kent Seeley, direktør for Senter for Drug Discovery og innovasjon (CDDI) Proteomikk Kjerne Facility ved University of South Florida for bruk av dette anlegget. Dette arbeidet ble støttet av NIH / NIDCD stipend R01 DC004295 til BHAs

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    8% Tris-acetate cartridge  Protein Discovery 42103
    Acetone Sigma-Aldrich 179124
    Acetonitrile Honeywell 015-1L
    AEBSF Calbiochem 101500
    Ammonium formate Fisher Scientific AC16861
    Aprotinin Calbiochem 616370
    ASB-14  Calbiochem 182750-5GM
    Bovine serum albumin BioRad 500-0112
    C18 column  New Objective A25112 75 μm x 10 cm 
    DC Protein Assay BioRad 500-0116 Microplate Assay Protocol
    EDTA Sigma-Aldrich E9884
    Endoproteinase Lys-C Sigma-Aldrich P3428
    FASP Protein Digestion Kit Protein Discovery 44250
    Formic acid  Fluka 94318
    GELFrEE Fractionation System Protein Discovery 42001 GELFrEE 8100
    Leupeptin Calbiochem 108975
    MacroSpin Column The Nest Group SMM SS18V Silica C18
    Microcystin Calbiochem 475815
    Pepstatin Sigma-Aldrich P5318
    Polysulfoethyl A Column The Nest Group 202SE0503
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
    Sonic Dismembrator  Thermo Fisher 15-338-53 Model 100
    Trypsin Sigma-Aldrich T6567 Proteomics Grade

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Domon, B., Aebersold, R. Review - Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
    2. Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
    3. Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
    4. Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
    5. Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , Humana ; Springer. New York, N.Y. (2009).
    6. Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
    7. Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
    8. Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
    9. Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. Plos One. 6, (2011).
    10. Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
    11. Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
    12. Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
    13. Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
    14. Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
    15. Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
    16. Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
    17. Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
    18. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
    19. Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
    20. Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. Mass spectrometry for proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).
    21. Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
    22. Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
    23. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
    24. Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
    25. Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
    26. Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).

    Tags

    Biokjemi Cochlear kromatografi LC-MS/MS massespektrometri proteomikk sensorisk epitel
    Bottom-up og Shotgun Proteomikk å identifisere en omfattende Cochlea Proteome
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B.… More

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B. H. A. Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome. J. Vis. Exp. (85), e51186, doi:10.3791/51186 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter