Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bottom-up och Shotgun Proteomics att identifiera en omfattande Cochlear Proteome

Published: March 7, 2014 doi: 10.3791/51186
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Summary

Proteomanalys av cochlea sensoriska epitelet kan vara en utmaning på grund av sin ringa storlek och eftersom membranproteiner är svåra att isolera och identifiera. Både membran och lösliga proteiner kan identifieras genom att kombinera flera preparativa metoder och separationstekniker tillsammans med högupplösande masspektrometri.

Abstract

Proteomik är en vanligt förekommande metod som kan ge insikter i komplexa biologiska system. Den cochlea sensoriska epitel innehåller receptorer som omvandlar den mekaniska energin av ljud i en elektrokemisk energi behandlas av de perifera och centrala nervsystemet. Flera proteomic tekniker har utvecklats för att studera cochlear innerörat, såsom två-dimensionell skillnad gelelektrofores (2D-DIGE), antikropp microarray och masspektrometri (MS). MS är den mest omfattande och mångsidigt verktyg i proteomik och i samband med separationsmetoder kan ge en fördjupad proteomen av biologiska prover. Separationsmetoder kombination med MS har förmågan att berika proteinprover, detektera lågmolekylära och hydrofoba proteiner och identifiera låga förekommande proteiner genom att minska proteomet dynamiskt område. Olika rötningsstrategier kan tillämpas på hela lysat eller fraktionerade protein lysat att öka peptid och proteinsekvenstäckning. Utnyttjande av olika separationstekniker, bland annat stark katjonbytare (SCX), omvänd fas (RP), och gel-elueras flytande fraktion entrapment elektrofores (gelfri) kan tillämpas för att minska prov komplexitet innan MS-analys för proteinidentifiering.

Introduction

Proteomik är studier av komplexa biologiska system genom att analysera proteinuttryck, funktion, modifieringar, och interaktioner 1. Flera metoder har använts för proteomanalys i innerörat, inklusive antikropp microarray 2, två-dimensionell gelelektrofores 3-5 och DIGE 6. Dock har endast ett begränsat antal proteiner identifierats och karakteriserats 2,7-10, jämfört med de över 10.000 gener och uttryckta sekvenstaggar (EST) som identifieras i innerörat 11,12, är MS den vanligaste och omfattande teknik i proteomik för proteinkarakterisering. Analys av komplexa proteomik prover, exempelvis snäckan, kan vara en utmaning. Men kombinationen av multipla separationstekniker med MS möjliggör identifieringen av ett större antal av peptider och proteiner, på grund av en ökad dynamisk koncentrationsintervall och toppkapacitet 13. Multidimensional chromatograPHY minskar mycket komplexa proteinblandningar genom att tillåta användning av olika adsorption mekanismer. Det finns två vanliga MS proteomanalys metoder, hagelgevär och bottom-up-proteomik. I shotgun proteomics, är en blandning av intakta proteiner enzymatiskt digererad och separerades med användning av flerdimensionell kromatografi med starka katjonbytar-kromatografi (SCX) följt av omvänd fas-vätskekromatografi (RPLC) 14,15. De separerade peptiderna utsätts för tandem MS-och databassökning 15. En stor fördel med denna teknik är att tusentals proteiner kan identifieras i en enda analys, och den teknik som är bättre anpassat till membranproteiner.

I bottom-up-strategi, är proteinblandning separeras, vanligen i form av en-eller tvådimensionell elektrofores, och de enskilda proteinbanden eller fläckar klippa ut och smältes med ett enzym såsom trypsin, oftast resulterar i flera peptider. Emellertid har en annan nyarely utvecklat elektro tillvägagångssätt, som används i bottom-up-proteomik, är gelfri. Denna teknik fraktionerar proteinprover i flytande fas och gör dem mindre komplex före analys. Denna teknik är reproducerbar, ger hög proteinutvinning, och reducerar spridningen av höga förekommande proteiner i komplexa proteinprover 16. Peptider, till följd av separerade proteiner, analyseras med MS, med hjälp av peptidmassfingeravtrycks eller tandem MS (MS / MS), för att skapa sekvens taggar för databasen söker 17-19. Några av de stora fördelarna med att använda det underifrånperspektiv är förmågan att få högupplösta separationer och omfattande protein täckning. Bottom-up proteomik är den mest använda tekniken i proteomik 20 därmed flera bioinformatikverktyg är tillgängliga. Dessutom kan proteiner separeras i en komplex blandning före digerering, så det finns en större chans att identifiering.

En av de stora utmaningarnaanvända innerörat för proteomik analys är dess ringa storlek, begränsad tillgänglighet, och celltyp mångfald 21. Dessutom nyckelproteiner som skiljer dess funktionalitet, såsom jonkanaler, transportörer och receptorer, är membranproteiner, som kan vara svåra att isolera 22. Således är förberedelse filter stödd prov (FASP) fördelaktigt för proteomik analyser av vävnader som är begränsade för proteinutvinning och som kräver rengöringsmedel för att lösa membran 23. Denna filtrering gör det möjligt att MS-analys av membran och lösliga proteiner och med avseende på förmågan att isolera peptider från lågmolekylära föroreningar 23,24.

Den nuvarande protokollet beskriver vanligen använda proteomik metoder som kombineras och modifieras för att analysera både lösliga och membranproteiner och att maximera antalet protein ID från cochlea sensoriska epitelet. Vi kommer att beskriva med hjälp av hagelgevär proteomik med FASP multi-smältaion, jonbyteskromatografi, högupplösande MS, och dataanalys. Dessutom kommer vi att beskriva bottom-up proteomik med gelfri, FASP flera matsmältning, högupplösande MS, och dataanalys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethics Uttalande

Experiment med möss vävnad godkändes av University of South Florida Institutional Animal Care och användning kommittén (protokoll 3931R, 3482R) som anges i riktlinjerna från National Institutes of Health.

1. Protein Extraction

  1. Isolera cochlea sensoriska epitel från 16 30 dagar gamla (P30) CBA / J möss och förvara vid -80 ° C.
  2. På dagen för experimentet, tvätta vävnaden med 500 | il av 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Centrifugera i 3 min vid 1000 xg, och avlägsna supernatanten. Upprepa för totalt tre tvättar.
  3. Sonikera vävnaden under 30 sek på is i 100 | il av lysbuffert innehållande 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 120 mM NaCl, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 500 | ig / ml AEBSF, 10 | ig / ml leupeptin, 100 ng / ml pepstatin, 2 ^ g / ml aprotinin, och 0,5 | ig / ml microcystin med användning av en sonisk Dismembrator (modell 100; Thermo Fisher). Cool lysat på is1 min mellan varje ultraljudsbehandling. Sonikera totalt 3x.
  4. Centrifugera extraktet vid 750 xg vid 4 ° C under 2 min och avlägsna supernatanten till ett nytt mikrorör. Extrahera pelleten i 50 | il lysbuffert genom sonikering under 30 s på is. Centrifugera extraktet vid 750 xg vid 4 ° C under 2 min. Kombinera båda lysaten och centrifugera vid 28.600 xg vid 4 ° C under 60 min. Avlägsna supernatanten till ett nytt mikrorör och tillsätt 20 | il lysbuffert innehållande 0,1% ASB-14 till pelleten. Vortex under 1 minut och inkubera i 60 min vid 4 ° C.
  5. Upphetta provet vid 95 ° C under 5 min, kyl sedan vid 4 ° C under 60 min. Följ upp med centrifugering vid 16000 x g vid 25 ° C under 10 min. Samla upp supernatanten och överföra till ett nytt rör.
  6. Centrifugera suspensionen vid 16000 x g vid 4 ° C under 5 min och bibehålla supernatanten för matsmältningen.

2. Dubbel Tryptisk Protein Digestion av Whole Lysate Använda FASP

  1. Lägg till en 30 μl alikvot (≤ 400 pg) av cochlea proteinextrakt, innehållande 4% natriumdodecylsulfat (SDS), 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 och 0,1 M ditiotreitol (DTT) direkt till en 30K spinnfilter och blanda med 200 pl av 8 M urea i Tris-HCl. Centrifugera vid 14000 xg under 15 min.
  2. Späd ut koncentratet med 200 ^ il 8 M urealösning och centrifugera vid 14000 xg under 15 min.
  3. Tillsätt 10 ul av 10x jodacetamid (IAA) i 8 M urealösning till koncentratet i filtret och vortex under 1 min. Inkubera spinnfiltret för 20 min vid rumstemperatur (RT) i mörker, följt av centrifugering vid 14000 x g under 10 min.
  4. Addera 100 pl av 8 M urealösning till koncentratet på filterenheten och centrifugera vid 14000 xg under 15 min. Upprepa detta steg 2x. Addera 100 pl av 50 mM ammoniumbikarbonat (ABC)-lösning i filterenheten och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Upprepa detta steg 2x.
  5. Lägg till 0,4 ug / ul trypsin i 1:100 (vikt / vikt) enzym-till-Proteinförhållande och inkubera över natten (O / N) vid 37 ° C.
  6. Efter inkubationen, till 40 ul av 50 mM ABC-lösning för att filtrera aggregatet och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Upprepa detta steg 1x.
  7. Tillsätt 50 | il av 0,5 M NaCl-lösning till spinnfiltret och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Överför filtratet innehållande de tryptiska peptiderna till ett färskt mikrorör och surgör med myrsyra (FA) till 1,0% för att stoppa digerering.
  8. Tvätta filterenheten med 40 ^ 8 M urea, och sedan tvätta 2x med 40 pl 18 Mohm vatten.
  9. Tvätta filterenheten 3x med 100 ul av 50 mM ABC-lösning. Efter den slutliga tvätten till 0,4 pg / pl trypsin på 1:100 (vikt / vikt) enzym-till-proteinförhållande och inkubera O / N vid 37 ° C.
  10. Eluera tryptiska peptider från det andra smälta genom att tillsätta 40 ul av 50 mM ABC lösning på filterenheten och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Upprepa detta steg 1x.
  11. Tillsätt 50 | il av 0,5 M NaCl-lösning tillfilterenhet och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Överför filtratet innehållande de tryptiska peptiderna till ett färskt mikrorör och surgör med FA till 1,0%.
  12. Proverna kan kvantifieras med användning av mikroplattan kolorimetrisk analys med användning av BSA som standard.

3. Endoproteinas LysC och Tryptisk Protein Digestion av Whole Lysate Använda FASP

  1. Lägg till en 30 | il alikvot (≤ 400 pg) av cochlea proteinextrakt innehållande 4% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 och 0,1 M DTT direkt till en 30K spinnfilter och blanda med 200 ul av 8 M urea i Tris-HCl- . Centrifugera vid 14000 xg under 15 min.
  2. Späd ut koncentratet med 200 ^ il 8 M urealösning och centrifugera vid 14000 xg under 15 min.
  3. Tillsätt 10 ul av 10x lAA i 8 M urealösning till koncentratet i filtret och vortex under 1 min. Inkubera spinnfiltret för 20 min vid RT i mörker sedan centrifugera vid 14.000 x g under 10 min.
  4. Tillsätt 100 l av 8 M urea solution till koncentratet på filterenheten och centrifugera vid 14000 xg under 15 min. Upprepa detta steg 2x. Addera 100 pl av 100 mM ABC lösning på filterenheten och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Upprepa detta steg 2x.
  5. Lägg till 0,1 ug / ul av endoproteinas LysC i en 01:50 (vikt / vikt) enzym-till-proteinförhållande och inkubera O / N vid 30 ° C.
  6. Efter inkubationen, till 40 ul av 100 mM ABC lösning på filterenheten och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Upprepa detta steg 1x.
  7. Tillsätt 50 | il av 0,5 M NaCl-lösning till spinnfiltret och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Överför filtratet innehållande lysC peptider till ett färskt mikrorör och surgör med FA till 1,0% för att stoppa digerering.
  8. Tvätta filterenheten med 40 ^ 8 M urea, och sedan tvätta 2x med 40 pl 18 Mohm vatten.
  9. Tvätta filterenheten 3x med 100 ul av 50 mM ABC-lösning. Efter den slutliga tvätten till 0,4 pg / pl trypsin i 1:100 enzym-till-protein-förhållande och inkubera O / N vid 37 ° C.
  10. Eluera tryptiska peptider genom att tillsätta 40 ul av 50 mM ABC lösning på filterenheten och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Upprepa detta steg 1x.
  11. Tillsätt 50 | il av 0,5 M NaCl-lösning i filterenheten och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Överför filtratet innehållande de tryptiska peptiderna till ett färskt mikrorör och surgör med 1,0% FA.
  12. Provet kan kvantifieras med hjälp av mikroplattan kolorimetrisk analys med BSA som standard.

4. Avsaltning Peptider Använda Spin Columns

  1. Aktivera en C 18 MacroSpin kolonnen genom tillsats av 500 | il av acetonitril (ACN) och centrifugera vid 1100 xg under 1 min. Kassera genomflödet efter centrifugering.
  2. Jämvikta kolonnen med 500 pl av 0,1% FA och centrifugera vid 1100 xg under 1 min. Kassera genomströmning och upprepa detta steg 1x.
  3. Lägg till upp till 500 l av peptiden smälta till kolumnen end centrifugera vid 1100 xg under 1 minut. Om provvolymen är större än 500 l sedan upprepa detta steg.
  4. Tvätta kolonnen med 500 pl av 0,1% FA och centrifugera vid 1100 xg under 1 min. Kassera genomströmning. Upprepa detta steg 1x.
  5. Addera 250 pl av en 90:10 ACN-till-vatten-förhållande till kolonnen och centrifugera vid 1100 xg under 1 min. Samla eluatet innehåller avsaltas peptider och överför till en fräsch mikrorör. Upprepa detta steg 1x.
  6. Torka avsaltade peptiden provet i en vakuumcentrifug och undvika att låta provet torka helt.

5. Jonbyteskromatografi

  1. Injicera 50-100 pg av rötat proteinprov på en 200 x 2,1 mm, 5 ìm SCX-kolonn (Polysulfoethyl A) för att separera peptider.
  2. Använd en gradient av 2-40% B under 50 min med en flödeshastighet av 250 ul / min. Lösningsmedel A är 5 mM ammoniumformiat, pH 3,0 i 25% acetonitril och 75% DDH 2 O. Lösningsmedel B är 500 mM ammoniumformiat, pH6,0 i 25% ACN och 75% DDH 2 O.
  3. Övervaka peptidfraktioner vid 280 nm, och samla upp fraktioner på 2 min intervaller med användning av en fraktionsuppsamlare.
  4. Torra fraktioner i ett vakuum anrikningsverk och återsuspendera i 500 l av 50% acetonitril i DDH 2 O innehållande 5% FA för att hjälpa till med salt bort.
  5. Återtorka fraktioner och förvara vid -80 ° C tills den ska användas för nano LC-MS/MS analys.

6. Aceton Utfällning

Före gelfri separation Cochlear proteinvätskan måste avsaltas. Aceton fällning kan användas för att avsalta och koncentrera proteiner.

  1. Lägg tre volymer iskall aceton till cochlea supernatanten. Vortexa försiktigt och inkubera vid -20 ° CO / N.
  2. Centrifugera provet blandningen vid 15000 x g under 15 min vid 4 ° C och avlägsna supernatanten.
  3. Tvätta proteinpellet 3x med kyld aceton och centrifugera vid 14.000 xg under 5 min vid 4° C.
  4. Lufttorka pellets och lös i 112 l av 18 Mohm vatten.
  5. Bestäm proteinkoncentration med användning av mikroplattan kolorimetrisk analys.

7. Gelfri Fraktionering av Cochlear sensoriska epitelet

  1. Tillsätt 30 ul av 5x provbuffert (0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (vikt / volym) SDS, 50% glycerol, 0,5% (vikt / vol) bromfenolblått) till den avsaltade protein suspenderades i 112 pl av 18 Mohm vatten.
  2. Lägg 8 | il av 1 M DTT och värm vid 95 ° C under 5 min för att minska protein disulfidbindningar. Efter upphettning tillåta kylning till rumstemperatur.
  3. Lägg till 8 ml av körningsbuffert till anodbehållare, 150 pl av löpbufferten till prov uppsamlingskammare och 6 ml löpbufferten till katodreservoaren.
  4. Ta bort alla buffert som kan ha strömmat in i provmatad kammare med hjälp av en pipett.
  5. Belastning 150 | il (≤ 1 mg) av den kokleära proteinblandningen, i provet-laddningskammaren med användning av en 8% Trär-acetat patron med en massa olika 3,5-150 kDa.
  6. Lägre elektroder och stäng locket instrument för att starta körningen.
  7. Vid den första paustiden på instrumentet lägg 2 ml löpbufferten till katodreservoaren och återuppta körningen.
  8. Vid varje pausad intervall på instrumentet, samla provet från provuppsamlingskammaren med hjälp av en pipett och lägga till en nyligen märkt mikrorör. Tvätta samling kammar 2x med 150 l av löpande buffert och kasta.
  9. Addera 150 pl av färsk rinnande buffert i provuppsamlingskammaren och återuppta körningen. Samla proteinfraktionerna under en tidsperiod av 2,6 h i en total volym av 150 | il / fraktion.

8. 1D gelelektrofores av gelfri Bråk

1D-elektrofores kan användas för att visualisera resultaten från gelfri fraktione före enzymatisk nedbrytning och MS-analys. Gelfri proteinfraktioner kan separeras på en 4-15% Tris-HCl-gel.

  • Blanda en 5 pl alikvot av varje gelfri fraktion med 5 ìl av provutspädningsbuffert (350 mM DTT i provbuffert).
  • Värm proverna vid 95 ° C under 3 min.
  • Cool prover till RT.
  • Fyll på 10 l av varje gelfri fraktion i enskilda gel körfält och belastning 5 ìl av molekylviktsstandard i sista oanvända körfält.
  • Kör gelen vid 125 V under 1,5 h eller tills färgen når botten av gelén.
  • Ta försiktigt bort gelen och färga med Silver Stain Plus att visualisera proteinseparation.

    • 9. Proteindigerering av gelfri Fraktioner Använda FASP

    En modifierad FASP förfarande används för att avlägsna detergent och digerering av gelfri fraktioner.

    1. Lägg varje enskild fraktion direkt till en 30K filterenhet, blandas med 200 pl 8 M urea i Tris-HCl och centrifugera vid 14.000 xg under 25 min.
    2. Späd ut koncentratet med 200 | il av urealösningenoch centrifugera vid 14000 xg under 12 min. Upprepa detta steg 1x.
    3. Tillsätt 10 ul av 10x lAA i urealösning till koncentratet i varje filterenhet, vortex under 1 min, och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur i mörker.
    4. Addera 100 pl av urealösning till koncentratet på filterenheterna och centrifugera vid 14000 xg under 15 min. Upprepa detta steg 2x. Addera 100 pl av 100 mM ABC lösning på filterenheterna och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Upprepa detta steg 2x.
    5. Lägg till 0,1 ug / ul av LysC för en 01:50 (vikt / vikt) enzym-till-proteinförhållande till filterenheterna och inkubera O / N vid 30 ° C.
    6. Efter inkubationen, till 40 ul av 100 mM ABC lösning på de spinnfilter och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Upprepa detta steg 1x.
    7. Tillsätt 50 | il av 0,5 M NaCl-lösning till de spinnfilter och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Överför filtratet innehållande lysC peptider från varje spinnfiltret till ett nytt mikrorör och surgör med trifluoroacetic-syra (TFA).
    8. Tvätta spin-filter med 40 ^ 8 M urea, tvätta sedan 2x med 40 pl 18 Mohm vatten.
    9. Tvätta spin filter 3x med 100 ul av 50 mM ABC-lösning. Efter den slutliga tvätten till 0,4 pg / pl trypsin i en 1:100 (vikt / vikt) enzym-till-proteinförhållande och inkubera O / N vid 37 ° C.
    10. Eluera tryptiska peptider från varje filterenhet genom att tillsätta 40 ul av 50 mM ABC-lösning och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Upprepa detta steg 1x.
    11. Tillsätt 50 | il av 0,5 M NaCl-lösning till filterenheterna och centrifugera vid 14000 xg under 10 min. Överför filtratet innehållande de tryptiska peptiderna från varje filterenhet till ett färskt mikrorör och surgör med TFA.
    12. Torka alla smälter i en vakuum koncentrator.

    10. Provberedning för LC-MS/MS

    1. Rekonstituera torkades LysC och tryptisk peptid digererar fraktioner i 20 pl av 0,1% FA och skaka.
    2. Centrifugera proverna vid 20.000 xg för 10min och ta bort den övre 95% av provet till en ny provflaska.
    3. Injicera 5 l av varje peptidfraktion på en 100 ìm x 25 mm prov fälla för att avlägsna salter och föroreningar och utför kromatografisk separation på en 75 ìm × 10 cm C 18-kolonn.
    4. Använd en gradient av 2-40% B under 100 min med en flödeshastighet av 200 nl / min. Lösningsmedel A är 95% ddH2O och 5% acetonitril innehållande 0,1% FA. Lösningsmedel B är 80% ACN-och 20% ddH2O innehållande 0,1% FA.
    5. Samla tio tandem mass spektra för varje MS skannar på en högupplösande masspektrometer. En LTQ Orbitrap masspektrometer användes i detta experiment.

    11. Protein Identification

    1. Identifiera proteiner med hjälp av UniProt musen databas som innehåller både framåt och bakåt proteinsekvenser och vanliga föroreningar. MaxQuant programvara med MASCOT sökmotor används för att söka på proteindatabasen.
    2. Sökningen parametrar som kan användas innefattar, fast MODIFICring av carbamidomethyl av cystein, variabla modifieringar av oxidation av metionin, protein N-terminal acetylering, max 2 missade klyvning. Den minsta peptidlängd att överväga för identifiering är sex aminosyror. Ange en peptid error masskoncentrationen av ± 8 ppm och ett fragment masstolerans på 1,2 Da (massa fel är beroende av masspektrometer som används).
    3. I MaxQuant programvara, använd en 1% falskt upptäckt ränta (FDR) för peptid-och proteinidentifiering. Proteinidentifiering är listad med antalet matchade peptider, den procentuella proteinsekvensen bevakning och peptidsekvenserna.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    För att få den mest omfattande proteomen av cochlea sensoriska epitel, är snabb vävnad dissektion krävs före protein extraktion och provberedning. Två proteomik tekniker kan användas, hagelgevär och bottom-up proteomik. För att framställa prover för shotgun proteomics ades FASP uppslutning användes såsom illustreras i figur 1. Den FASP Metoden möjliggör koncentration av proteiner, avlägsnande av tvättmedel, och nedbrytning av proteiner med hjälp av flera enzymer. Det fanns två dubbla rötningsförfaranden som används, den första var en tryptisk nedbrytning följt av en andra uppslutning med trypsin, som slogs samman, fraktionerades på en SCX-kolonn i 18 fraktioner och analyseras av nano LC-MS/MS. Totalt 1,485 proteiner identifierades med en 1% FDR när du utför en enda-run LC-MS/MS använda denna experimentella strategi. Bland de identifierade proteinerna, var 329 och 258 proteiner som kategoriseras i mitokondrien och plasmamembran, respektive (figur2A). Den andra dubbel uppslutning bestod av LysC matsmältning följt av trypsin matsmältningen. Varje sammandrag var individuellt laddad och separeras på SCX-kolonn i 18 fraktioner och analyseras av nano LC-MS/MS. Resultaten av LysC och trypsin digere producerade totalt 3503 proteiner med en 1% FDR. Figur 2B visar att 605 och 617 proteiner kategoriserades i mitokondrien och plasmamembran, respektive. Detta tillvägagångssätt lämnat det största antalet membranassocierade protein ID. Duplicera analys av LysC och trypsin fraktioner visade mer än 65% av proteinerna identifierade delades mellan experimenten. Det fanns emellertid också nyligen identifierade proteiner i replikat analys. De extra peptider och proteiner identifierades på grund av små förändringar i kromatografi, därför leder till olika peptider för fragmentering 25.

    Bottom-up proteomik applicerades med hjälp gelfri fraktioneföre LC-MS/MS såsom illustreras i figur 3. Det fanns 12 gelfri fraktioner som samlats. Före digestion och LC-MS/MS analys, ett silver-färgade gelén var beredd att visualisera resultaten från gelfri fraktionering såsom visas i fig. 4. Gelen visade proteinseparation genom att öka molekylvikten för varje rad fraktion. Därför var de 12 gelfri flytande fraktioner rötas med två olika multi FASP matsmältningen metoder och analyseras av LC-MS/MS. Den första digestion tillvägagångssätt utfördes med användning av en dubbel trypsindigerering, vilket ledde till identifiering av 2165 proteiner med en 1% FDR vid utförande av en enkelsträng LC-MS/MS. Figur 5A visar att det fanns 516 och 399 proteiner kategoriseras i mitokondrien och plasmamembran, respektive. Den andra matsmältning tillvägagångssätt utfördes med hjälp av endoproteinas LysC följt av trypsin matsmältningen. Single-run LC-MS/MS analysen identifierades 2211 proteiner med en 1% FDR. Dettatillvägagångssätt uppvisade ett liknande antal membranassocierade proteiner som vid användning av trypsin / trypsin strategi (Figur 5B). De masspektrometri proteomik data har deponerats till ProteomeXchange Consortium 26 med data set identifier PXD000231 25. Kombinering av resultaten från de olika tekniker resulterade i ett stort antal membran och lösliga proteiner från mus cochlea sensoriska epitelet (fig 6).

    Figur 1
    Figur 1. Schematisk bild av ett hagelgevär proteomic experiment med användning FASP, jonbyteskromatografi och högupplösande MS. Proteiner extraheras, solubiliseras, och digererades med användning FASP med LysC och trypsin endoproteinases. Den LysC (grön slang) och tryptiska peptider (lila rör) är uppdelade i mindre komplicerade fraktioner med hjälp SCX-kromatografi och analyseras med hjälp av nano LC-MS/MS. Maskoten sökmotor användes för att behandla MS-data för proteinidentifiering. Klicka här för att visa en större bild.

    Figur 2
    Figur 2. GO cellkomponentema profilen av protein ID: n när man utför en (A) första och andra spjälkning med trypsin följt av SCX separation och (B) först digerering med LysC följt av en andra spjälkning med trypsin följt av SCX separation. Alla kategorier räknas ickeexklusivt, när ett protein har mer än en kategori för cellulära komponenter.es.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

    Figur 3
    Figur 3. Schematisk bild av en bottom-up proteomik experiment med gelfri, FASP, och högupplösta MS. Extraherade proteiner solubiliseras och proteiner fälls ut med hjälp av aceton (blå slang) för att avlägsna salter och oönskade föroreningar från lysatet. Proteinet pelleten solubiliseras och proteinerna fraktionerades med användning gelfri. Varje fraktion digererades genom användning FASP med LysC och trypsin endoproteinases. Den LysC (gröna rör) och tryptiska peptider (lila rör) från varje fraktion analyseras med nano LC-MS/MS och proteiner identifieras genom att söka MS-data med hjälp av maskot. Klicka här för att visa stora r bild.

    Figur 4
    Figur 4. Silver-färgad gel av cochlear sensoriska epitelet gelfri fraktioner, för att visualisera proteinseparation i varje fraktion före MS-analys. (M) Protein markör, (1) Fraktion 1, (3) Fraktion 2, (5) Fraktion 5, (7) Fraktion 7, (8) Fraktion 8, (9) Fraktion 9, (10) Fraktion 10, (11) Fraktion 11, (12) Fraktion 12. Omtryckt (anpassad) med tillstånd från Darville och Sokolowski 24. Copyright 2013 av American Chemical Society. Klicka här för att visa en större bild.

    / Files/ftp_upload/51186/51186fig5.jpg "/>
    Figur 5. GO cellkomponentema profilen av protein ID: n när man utför en (A) första och andra spjälkning med trypsin efter gelfri separation och (B) först digerering med LysC följt av en andra spjälkning med trypsin efter gelfri separation. Alla kategorier räknas ickeexklusivt, När ett protein har mer än en kategori för cell-delar. Klicka här för att visa en större bild.

    Figur 6
    Figur 6. GO cellulära komponenter profil för alla de proteiner som identifierats med hjälp av SCX, WAX, eller gelfri separation. När ett protein som hade mer än en kategori för cell-delar, alla dess kategoris räknades ickeexklusivt. Klicka här för att visa en större bild.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    De viktigaste stegen för att maximera proteinidentifiering från cochlea sensoriska epitel är: 1) användning av flera endoproteinases för matsmältningen, 2) användning av flera separationstekniker, och 3) utnyttjande av en högupplösande masspektrometer. Tillämpningen av ett flertal enzymer ökar antalet peptider och förbättrar proteinsekvens täckning, därmed förbättra antalet identifierade proteiner från cochlea vävnaden. Trypsin, den vanligast använda proteas ger effektiv och specifik klyvning av proteiner, generera peptider som är bra för MS jonisering och fragmentering. Men med hjälp av ett annat enzym före trypsin, såsom LysC, som också klyver på lysin rester, ger effektivare peptid klyvning. Det observerades att den sekvens täckning av proteinerna som genererats från den LysC / trypsindigerering visade en ökning i proteinsekvensen täckning i förhållande till proteinsekvenstäckning från trypsin / trypsin-digerering.

    ove_content "> Genomförande av flerdimensionell separation före MS reducerade hög cochlear prov komplexitet i hagelgevär proteomic tillvägagångssätt. Detta möjliggjorde identifiering av flera proteiner, inklusive membranproteiner, vilka typiskt är svåra att identifiera. Ett större antal membranproteiner identifierades med användning av geväret strategi i motsats till underifrånperspektiv. Men. här är det underifrånperspektiv med hjälp gelfri tillåts för identifiering av fler låga rikliga proteiner på grund av isoleringen av högre rikliga proteiner, såsom cochlin från snäckan, i enskilda fraktioner.

    De högkvalitativa uppgifter som uppnås i det nuvarande protokollet med en högupplösande masspektrometer, såsom en LTQ-Orbitrap, förbättrar och ökar antalet proteiner som kan identifieras i snäckan. Den LTQ-Orbitrap ger hög upplösning, hög massa noggrannhet och hög känslighet för analys av peptider. Därför tillämpningen av detta instrument Enables identifiering av proteiner från komplexa biologiska prover, såsom kokleära sensoriska epitelet och förbättrar identifiering av mycket små mängder peptider. Utnyttjande av dessa kombinerade experimentella metoder med kraftfullt verktyg för MS hjälper till att avsevärt öka cochlea protein dataset, detta förbättrar möjligheten att identifiera nya protein biomarkörer involverade i hörsel och dövhet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.

    Acknowledgments

    Författarna tackar Dr Kent Seeley, chef för Centrum för Drug Discovery och innovation (CDDI) Proteomics Core Facility vid University of South Florida för att använda denna möjlighet. Detta arbete stöddes av NIH / NIDCD bidrag R01 DC004295 till BHAs

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    8% Tris-acetate cartridge  Protein Discovery 42103
    Acetone Sigma-Aldrich 179124
    Acetonitrile Honeywell 015-1L
    AEBSF Calbiochem 101500
    Ammonium formate Fisher Scientific AC16861
    Aprotinin Calbiochem 616370
    ASB-14  Calbiochem 182750-5GM
    Bovine serum albumin BioRad 500-0112
    C18 column  New Objective A25112 75 μm x 10 cm 
    DC Protein Assay BioRad 500-0116 Microplate Assay Protocol
    EDTA Sigma-Aldrich E9884
    Endoproteinase Lys-C Sigma-Aldrich P3428
    FASP Protein Digestion Kit Protein Discovery 44250
    Formic acid  Fluka 94318
    GELFrEE Fractionation System Protein Discovery 42001 GELFrEE 8100
    Leupeptin Calbiochem 108975
    MacroSpin Column The Nest Group SMM SS18V Silica C18
    Microcystin Calbiochem 475815
    Pepstatin Sigma-Aldrich P5318
    Polysulfoethyl A Column The Nest Group 202SE0503
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
    Sonic Dismembrator  Thermo Fisher 15-338-53 Model 100
    Trypsin Sigma-Aldrich T6567 Proteomics Grade

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Domon, B., Aebersold, R. Review - Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
    2. Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
    3. Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
    4. Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
    5. Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , Humana ; Springer. New York, N.Y. (2009).
    6. Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
    7. Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
    8. Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
    9. Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. Plos One. 6, (2011).
    10. Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
    11. Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
    12. Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
    13. Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
    14. Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
    15. Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
    16. Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
    17. Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
    18. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
    19. Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
    20. Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. Mass spectrometry for proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).
    21. Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
    22. Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
    23. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
    24. Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
    25. Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
    26. Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).

    Tags

    Biokemi Cochlear kromatografi LC-MS/MS masspektrometri proteomik sensoriska epitel
    Bottom-up och Shotgun Proteomics att identifiera en omfattande Cochlear Proteome
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B.… More

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B. H. A. Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome. J. Vis. Exp. (85), e51186, doi:10.3791/51186 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter