Espressione, isolamento e purificazione di solubili e insolubili Biotinylated proteine per Nerve Tissue Regeneration
Summary
Sviluppo di proteine di fusione biotinylatable ha molte potenziali applicazioni in diversi campi di ricerca. Ingegneria proteina ricombinante è una procedura dritto in avanti che è costo-efficace, che fornisce alte rese di proteine personalizzati.
Abstract
Ingegneria proteica ricombinante ha utilizzato Escherichia coli (E. coli) sistemi di espressione per quasi 4 decenni, e oggi E. coli è ancora dell'organismo ospite più utilizzato. La flessibilità del sistema consente l'aggiunta di frazioni come per esempio un tag biotina (per interazioni streptavidina) e proteine funzionali più grandi come proteina fluorescente verde o ciliegio proteina rosso. Inoltre, l'integrazione di amminoacidi innaturali come chelanti di ioni metallici, gruppi funzionali reattivi univoco, sonde spettroscopiche, e molecole che impartiscono modificazioni post-traduzionali ha permesso una migliore manipolazione delle proprietà proteiche e funzionalità. Di conseguenza questa tecnica crea proteine di fusione personalizzabili che offrono utilità significativa per vari campi di ricerca. Più specificamente, la sequenza proteica biotinylatable è stato incorporato in molte proteine bersaglio a causa della elevata interazione affinità tra biotina con avidina e streptavidina. Questa aggiunta ha aiutato a migliorare la rilevazione e purificazione di proteine nella categoria oltre ad aprire la strada ad applicazioni secondarie, come l'ordinamento delle cellule. Così, molecole di biotina marcata mostrano una crescente influenza e diffusa nei campi bioindustriale e biomedica. Ai fini della nostra ricerca abbiamo ingegnerizzato proteine di fusione biotinilato ricombinanti contenenti il fattore di crescita nervoso (NGF) e semaphorin3A (Sema3A) regioni funzionali. Abbiamo precedentemente riportato come queste proteine di fusione biotinilato, insieme ad altre sequenze proteiche attive, possono essere legati a biomateriali per l'ingegneria tissutale e scopi rigenerativi. Questo protocollo delinea le basi delle proteine ingegneria biotinylatable alla scala milligrammo, utilizzando un T7 lac inducibile vettoriale e E. padroni di espressione coli, a partire da trasformazione di scale-up e di purificazione.
Introduction
Proteine coprono una vasta gamma di biomolecole che sono responsabili di molte funzioni biologiche, portando in definitiva a formazione di tessuto corretto e organizzazione. Queste molecole iniziano migliaia di vie di segnalazione che controllano up-regulation e / o down-regolazione dei geni e delle altre proteine, mantenendo l'equilibrio all'interno del corpo umano. Rottura di una singola proteina colpisce tutta questa rete di segnali, che può portare alla comparsa di disturbi o malattie devastanti. Ingegneria singole proteine in laboratorio offre una soluzione per la lotta contro questi effetti collaterali e offre un'alternativa ai farmaci a piccole molecole. Nel 1977, un gene che codifica la sequenza amminoacidica somatostatina 14 è stato uno dei primi polipeptidi ingegnerizzati creati utilizzando E. coli 1. Poco dopo, nel 1979, l'insulina è stato clonato in plasmide pBR322, trasformato, espresso e purificato 2. Da allora, proteine ricombinanti hanno esteso la loro influenza per più campi di research come biomateriali, drug delivery, l'ingegneria dei tessuti, prodotti biofarmaceutici, agricoltura, enzimi industriali, biocarburanti, ecc (per una rassegna vedi riferimenti 3-8). Ciò è dovuto alla versatilità che la tecnica offre tramite l'aggiunta di applicazioni porzioni chimiche specifiche o sequenze proteiche per scopi che includono, ma non limitato a, l'identificazione delle proteine bersaglio, stabilizzazione e purificazione.
Tramite la tecnologia del DNA ricombinante, proteine ricombinanti possono essere espressi in una varietà di sistemi ospite eucariotiche e procariotiche inclusi mammiferi, insetti, piante, lieviti, funghi o batteri. Ogni host offre diversi vantaggi e tipicamente il miglior sistema è determinato sulla base della funzione della proteina, resa, stabilità, costi complessivi e scalabilità. Cellule dei batteri spesso mancano i meccanismi di modificazione post-traslazionale che ospita eucariotiche forniscono (ad esempio la glicosilazione, disolfuro di transizione, e tc.) 5. Di conseguenza, i sistemi di mammiferi e insetti solito risultato migliore compatibilità e l'espressione di proteine eucariotiche, tuttavia questi host sono generalmente più costosi e 9 richiede tempo. Pertanto, E. coli è l'ospite privilegiato per il nostro sistema di espressione perché le cellule si espandono rapidamente in condizioni di crescita economici ed i meccanismi di espressione genetica sono ben compresi 5,9. Inoltre, questo sistema è facile da scalare, per scopi produttivi e dei risultati in proteine funzionali nonostante la mancanza di modificazioni post-traslazionali 10. Il E. coli K12 è scelto in questo protocollo per la clonazione, perché questo ceppo offre ottimi rendimenti plasmide basato su alte efficienze di trasformazione. Inoltre, un E. coli BL21 è utilizzato per l'espressione perché questo ceppo ospite contiene il gene della polimerasi T7 RNA che fornisce l'espressione proteica controllata e stabilità 11.
tenda "> Dopo la selezione ospitante, inoltre bisogna fare attenzione nella scelta del vettore di espressione ideale per facilitare l'espressione della proteina selezionata e controllata. Sintetizzando proteine ricombinanti inizia con una sequenza di DNA bersaglio che è clonato sotto la direzione del batteriofago T7 trascrizione e traduzione segnali, e espressione viene indotta in cellule ospiti contenenti copie cromosomiche del gene T7 RNA polimerasi 12. Questi vettori derivati da pBR322 plasmide vettore (per una rassegna vedi riferimento 13), sono strettamente controllato dal promotore T7 sviluppato inizialmente da Studier e colleghi 14 e fornire ulteriori controllo attraverso l'inclusione dell'operatore lac e repressore lac (lac1) 15,16. Per ingegneria proteica ricombinante, questo sistema di espressione offre la possibilità di personalizzare una specifica sequenza amminoacidica di una proteina desiderata inserendo diverse sequenze di DNA bersaglio o per creare proteine di fusione costituiti di dominio combinatos da singole proteine. Inoltre, alcune serie vettore comprendono peptide modifiche tag per essere immessi sul N o C terminus. Per i nostri scopi di progettazione, una istidina (His) tag è stato aggiunto alla sequenza bersaglio di DNA per la purificazione e una sequenza amminoacidica biotinylatable 15 è stato incluso per biotinylation 17,18. In questo protocollo un plasmide contenente un gene di resistenza all'ampicillina, è stato scelto per portare le sequenze di proteine di fusione biotinylatable. Espressione è controllata in questo vettore tramite il T7 promotore lac ed è facilmente indotta con isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).Espressioni di prova (colture su piccola scala) vengono utilizzati per determinare la presenza e la solubilità della proteina bersaglio, che può essere espresso sia in una forma solubile o insolubile formulare procedure di purificazione. Una proteina solubile espressa all'interno della cellula batterica subirà pieghevole spontanea di mantenere la sua struttura nativa 19. Tipicamente il nativostruttura è termodinamicamente favorevole. In molti casi l'attività metabolica dell'ospite non è favorevole alla proteina bersaglio, ponendo sollecitazioni al sistema che porta alla produzione di proteine insolubili e la formazione di corpi di inclusione composti di aggregati proteici insolubili. Così la proteina bersaglio denatura, rendendoli generalmente biologicamente inattivo 20. Entrambe le espressioni di prova sono scalati-up, e procedure di isolamento sono determinate dalla solubilità della proteina bersaglio. È necessaria una rinaturazione supplementare o ripiegamento passo per le proteine insolubili. Le proteine ricombinanti risultanti possono essere ulteriormente purificati mediante cromatografia ad esclusione dimensionale.
In casa produzione di proteine ricombinanti offre vantaggi economici rispetto ai prodotti commerciali dal milligrammi di proteina bersaglio possono essere isolati per litro di coltura principale. La maggior parte delle attrezzature necessarie è disponibile in un tipico laboratorio biologico o chimico. Ingegneria proteica consente la creazionedi proteine di fusione personalizzato con ulteriori funzionalità che non sempre sono disponibili in commercio. figura 1 illustra i principali procedure necessarie proteine ricombinanti ingegneria. Con questo sistema di espressione abbiamo creato molte proteine biotinylatable, come l'interferone-gamma, fattore di crescita derivato dalle piastrine, e la proteina morfogenetica dell'osso, 21-23, ma ci concentreremo su due proteine che abbiamo progettato per la guida degli assoni, NGF (29 kDa ) e Sema3A (91 kDa) 10 (per una rassegna vedi riferimento 24). Biotinylation è una tecnica comune per l'identificazione, immobilizzazione e l'isolamento di proteine marcate utilizzando il noto interazione biotina-streptavidina 25-27. Sonde biofisiche 28,29, biosensori 30 e 31 punti quantici sono alcuni esempi di sistemi che utilizzano l'alta affinità della biotina-streptavidina coniugazione con una K d dell'ordine di 10 -15 M 27. Il E. bio coliligasi stagno, Bira, aiuti nel legame covalente di biotina alla catena laterale di lisina trovati all'interno della biotina etichettato sequenza di 18,32. Tethering biotina ai materiali e biomolecole ha prodotto la consegna sostenuto di fattori di crescita per cellulare per molteplici applicazioni di ingegneria tissutale 21,33-35. Pertanto, ingegneria queste proteine biotinylatable progettati su misura è un potente strumento che può trascendere molteplici interessi di ricerca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ingegneria proteina ricombinante è una tecnica molto potente che abbraccia molte discipline. Si è costo-efficace, regolabile e una procedura relativamente semplice, consentendo la produzione di alte rese di proteine personalizzati. È importante notare che la progettazione ed esprimere proteine bersaglio non è sempre semplice. Espressione basale e la stabilità della proteina ricombinante dipendono da specifiche scelte di vettore, E. coli cellulari, peptide tag aggiunte e parametri colturali. Il …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare l'Università di Akron per il finanziamento che ha sostenuto questo lavoro.
Materials
| 1,4-dithio–DL-threitol, DTT, 99.5% | Chem-Impex International | 127 | 100 g |
| 2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol | Chem-Impex International | 642 | 250 ml |
| Acetic acid, glacial | EMD | AX0073-9 | 2.5 L |
| Agar | Bioshop | AGR001.500 | 500 g |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | 25 g |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich | A6426 | 500 g |
| Barstar-NGF pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | 1 ml; Expression Host |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | 500 ml |
| BugBuster | Novagen | 70922-3 | 100 ml |
| Gel filtration standard | Bio-Rad | 151-1901 | 6 vials |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | 1 L |
| Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride | Chem-Impex International | 152 | 1 kg |
| His-Pur Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88222 | 100 ml |
| Hydrochloric acid | EMD | HX0603-3 | 2.5 L |
| Imidazole | Chem-Impex International | 418 | 250 g |
| IPTG | Chem-Impex International | 194 | 100 g |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 30 ml |
| Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface | Chem-Impex International | 270 | 500 g |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | 1 kg |
| NovaBlue Competent Cells | Novagen | 69825 | 1 ml; Cloning Host |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Potassium Chloride | Chem-Impex International | 01247 | 1 kg |
| Sema3A-pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 1 L |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | 1 kg |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| Sodium phosphate diabasic | Sigma-Aldrich | S5136-500G | 500 g |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | 500 g |
| Terrific Broth | Bioshop | TER409.5 | 5 kg |
| Tetracycline hydrochloride | Chem-Impex International | 667 | 25 g |
| Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X | Bio-Rad | 1610732 | 1 L |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Tryptone, pancreatic | EMD | 1.07213.1000 | 1 kg |
| Yeast extract, granulated | EMD | 1.03753.0500 | 500 g |
| Name of Kits/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ÄKTApurifier10 | GE Healthcare | 28-4062-64 | Includes kits and accessories |
| Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | MAXQ 4000 |
| BirA500 | Avidity | BirA500 | Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution |
| Dialysis Casette | Thermo Scientific | 66380 | Slide-A-Lyzer (Extra Strength) |
| Dialysis Tubing | Spectrum Laboratories | 132127, 132129 | MWCO: 25,000 and 50,000 |
| Flow Diversion Valve FV-923 | GE Healthcare | 11-0011-70 | |
| FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit | Invitrogen | 1094598 | |
| Frac-950 Tube Racks, Rack C | GE Healthcare | 18-6083-13 | |
| Fraction Collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | Includes kits and accessories |
| Heated/Refrigerated Circulator | VWR | 13271-102 | Model 1156D |
| Heating Oven FD Series | Binder | Model FD 115 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 17-1069-01 | Discontinued–Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg |
| J-26 XPI Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | 393126 | |
| JA 25.50 Rotor | Beckman Coulter | 363055 | |
| JLA 8.1 Rotor | Beckman Coulter | 969329 | Includes 1 L polyporpylene bottles |
| JS 5.3 Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Laminar Flow Hood | Themo Scientific | 1849 | Forma 1800 Series Clean Bench |
| Microplate Reader | TECAN | infinite M200 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8004 | 4-gel vertical electrophoresis system |
| Mini-PROTEAN TGX Precast Gels | Bio-Rad | 456-9036 | Any kDa, 15-well comb |
| Ni-NTA Column | Bio-Rad | 737-2512 | 49 ml volume ECONO-Column |
| Plasmid Miniprep Kit | OMEGA bio-tek | D6943-01 | |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 164-5052 | 250 V, 3 A, 300 W |
| Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes | VWR | 3119-0050 | 50 ml tubes for JA 25.50 rotor |
| Spin-X UF Concentrators | Corning | 431488, 431483 | 20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da |
| Subcloning Service | GenScript USA Inc. | Protein Services | |
| Ultrasonic Processor | Cole-Parmer | 18910445A | Model CV18 |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 |
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