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Biotechnik

神経組織再生のための可溶性および不溶性ビオチン化タンパク質の発現、分離、および精製

Published: January 22, 2014
doi:
10.3791/51295
, , ,
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering,University of Akron

Summary

biotinylatable融合タンパク質を開発することは、研究の様々な分野で多くの潜在的な用途がある。組換えタンパク質工学は、カスタム設計されたタンパク質を高収率で提供する、費用対効果のある単純な手順である。

Abstract

組換えタンパク質工学は、 大腸菌（E.coli）発現ほぼ40年のためのシステム、今日Eを利用している大腸菌はまだ最も広く使用されている宿主生物である。システムの柔軟性は、（ストレプトアビジン相互作用のための）ビオチンタグなどの部分と緑色蛍光タンパク質またはチェリーレッドのタンパク質のような大きな機能性タンパク質を付加することができます。また、翻訳後修飾を付与する金属イオンキレート剤、一意的に反応性官能基、分光学的プローブ、および分子などの非天然アミノ酸の組込みは、タンパク質の特性及び機能のより良好な操作を可能にした。その結果、この技術は研究の様々な分野のための重要なユーティリティを提供し、カスタマイズ可能な融合タンパク質を作成します。具体的には、biotinylatableタンパク質配列が原因アビジンおよびストレプトアビジンとビオチンとの間の高親和性相互作用の多くの標的タンパク質に組み込まれている。この追加により、タグ付けされたタンパク質の検出および精製を強化するだけでなく、このような細胞選別などの二次アプリケーションのための道を開くことに支援しています。このように、ビオチン標識分子がbioindustrialおよび生物医学分野で増加し、広範な影響力を示している。本研究の目的のために、我々は、神経成長因子（NGF）およびsemaphorin3A（Sema3Aの）機​​能的領域を含む組換えビオチン化融合タンパク質を設計している。我々は、これらのビオチン化融合タンパク質は、他の活性なタンパク質配列と共に、組織工学および再生の目的のための生体材料に繋留することができる方法を以前に報告した。このプロトコルは、T7 LAC誘導ベクターおよびEを利用し、ミリグラム規模でエンジニアリングbiotinylatableタンパク質の基礎を概説形質転換からのスケールアップおよび精製を開始大腸菌発現宿主、。

Introduction

タンパク質は、最終的に適切な組織形成、組織を導く、多くの生物学的機能に関与している生体分子の広い範囲をカバーする。これらの分子は、人体内の均衡を維持し、規制アップ及び/またはダウンレギュレーション遺伝子および他のタンパク質を制御するシグナル伝達経路の数千を開始する。単一のタンパク質の破壊は、壊滅的な障害または疾患の発症につながることができた信号のこのウェブ全体に影響します。ラボで個々のタンパク質を設計することは、これらの悪影響に対処するための一つの解決策を提供しており、低分子薬物に代わるものを提供しています。 1977年には、14個のアミノ酸ソマトスタチン配列をコードする遺伝子は、E.を使用して作成された第一の操作されたポリペプチドの一つであった大腸菌 1。まもなく1979年の後、インスリンは、形質転換、プラスミドpBR322にクローニングし、発現させ、精製した2。それ以来、組換えタンパク質は、解像度の複数のフィールドに自分の影響力を拡大しているearch などの生体材料、ドラッグデリバリー、組織工学、バイオ医薬品、農業、産業用酵素、バイオ燃料として（レビューは参考文献3-8を参照してください）。これは、技術には、目的のために、化学的部分またはタンパク質配列の特定のアプリケーションの添加を介して提供し、これらに限定されないが、タンパク質同定、安定化および精製を標的とすることが汎用性によるところが大きい。

組換えDNA技術によって、組換えタンパク質は、哺乳動物、植物、昆虫、酵母、真菌、または細菌を含む真核生物および原核生物宿主系の種々の発現させることができる。各ホストは異なる利点を提供し、通常は最高のシステムは、タンパク質機能、収率、安定性、全体的なコスト、および拡張性に基づいて決定される。細菌細胞は、多くの場合、真核生物宿主（ すなわちグリコシル化、ジスルフィドブリッジ、Eを提供する翻訳後修飾のメカニズムを欠いている TC。）5。しかしながら、これらのホストは、典型的にはより高価で時間のかかる09であり、その結果、哺乳動物および昆虫システムは、通常、真核生物のタンパク質のより良好な相溶性および発現をもたらす。従って、E.細胞は、安価な増殖条件および遺伝子発現機構において急速に拡大しているため、大腸菌は、よく理解されている5,9は、我々の発現システムのための好まれる宿主である。さらに、このシステムは、翻訳後修飾10の欠如にもかかわらず、機能的なタンパク質の生産を目的とし、その結果のためのスケールアップが容易である。 E.この株は、高い形質転換効率に基づいた優れたプラスミド収量を提供していますので、 大腸菌 K12株は、クローニングのために、このプロトコルで選択される。さらに、E.この宿主株は、制御されたタンパク質の発現および安定性11を提供するT7 RNAポリメラーゼ遺伝子が含まれているため、 大腸菌 BL21株は、発現のために利用される。

10トン ">ホスト選択後、さらなる注意が組換えタンパク質を合成することは、バクテリオファージT7転写および翻訳シグナルの指示の下でクローン化され、標的DNA配列で始まる。選択され、制御されたタンパク質の発現を促進するために理想的な発現ベクターを選択する際に注意しなければならず発現は、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子12の染色体コピーを含有する宿主細胞において誘導される。プラスミドベクターpBR322に由来するこれらのベクターは、（レビューのためには、13を参照する参照）、しっかりと最初にStudierら14によって開発されたT7プロモーターによって制御され、付加的に提供されているlacオペレーター 、およびlacリプレッサー（LAC1）15,16の包含を介して制御組換えタンパク質工学では、この発現系は、異なる標的DNA配列を挿入することにより、所望のタンパク質の特定のアミノ酸配列を調整するまたは融合タンパク質を作成する機能を提供合わせたドメインから構成されるシングルタンパク質からのS。さらに、いくつかのベクターシリーズはN又はC末端上に配置するペプチドタグ修飾を含む。我々の設計のために、ヒスチジン（His）タグは、精製の ​​ためのDNA標的配列に加え、15個のアミノ酸配列は、ビオチン化biotinylatable 17,18のために含めた。このプロトコルでは、アンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドは、我々のbiotinylatable融合タンパク質配列を運ぶために選択した。発現はT7のlacプロモーターを介してこのベクター中に制御され、容易にイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導される。

テスト式（小スケールの培養物）を、精製手順のいずれかを処方するために可溶性または不溶性の形態で発現することができる標的タンパク質の存在および溶解度を決定するために使用される。細菌細胞内で発現される可溶性タンパク質は、その天然の構造体19を維持するために自発的なフォールディングを受けることになる。通常、ネイティブ構造は熱力学的に有利である。多くの場合、宿主の代謝活性は、不溶性タンパク質産生および不溶性タンパク質凝集体からなる封入体の形成をもたらすシステムにストレスを与え、標的タンパク質に資するものである。従って、標的タンパク質は20生物学的に不活性な、一般的にそれらをレンダリングする、変性させる。両方のテスト式は、アップスケーリングされ、および単離手順は、標的タンパク質の溶解度によって決定される。追加の再生またはリフォールディングステップは不溶性タンパク質のために必要である。得られた組換えタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製することができる。

家の中での組換えタンパク質産生は、標的タンパク質のミリグラム本培養のリットルあたり単離することができるので、市販品よりもコストの利点を提供する。必要な機器のほとんどは、一般的な生物学的または化学実験室で提供されています。タンパク質工学の作成を可能に常に市販されていない追加された機能を持つカスタムの融合タンパク質の。 図1は、組換えタンパク質を工学に関わる主な手順を示している。この発現系では、我々は、インターフェロン-γ、血小板由来増殖因子、および骨形成タンパク質21〜23のような多くのbiotinylatableタンパク質を、作成しているが、我々は我々が軸索ガイダンス、NGF（29 kDaのために設計された二つのタンパク質に焦点を当てます）とのSema3A（91 kDa）の10（レビューのための基準24を参照）。ビオチン化はよく知られているビオチン-ストレプトアビジン相互作用を利用して25-27標識タンパク質の同定、単離および固定化のための一般的な技術である。生物物理学的なプローブ28,29、バイオセンサ30と、量子ドット31は、10 27 -15 MのオーダーのK dで、ビオチン-ストレプトアビジン結合の高い親和性を利用するシステムのいくつかの例である。 E.大腸菌バイオスズリガーゼ、BirAをは、ビオチンタグの付いたシーケンス18,32内で見つかったリジン側鎖へのビオチンの共有結合を助ける。材料や生体分子へのテザリングビオチンは、複数の組織工学適用21,33-35用セルに成長因子の持続性送達を生産している。したがって、これらのカスタム設計biotinylatableタンパク質を設計することは複数の研究の利益を超越することができる強力なツールです。

Protocol

1。標的タンパク質の設計バイオテクノロジー情報のウェブサイトのためのナショナルセンターを使用して（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）考慮対象種と任意のスプライスバリアントを取る目的のタンパク質のアミノ酸配列を得る。タンパク質の関心の活性領域に対応するアミノ酸配列を選択します。 注：Sema3Aのために、アミノ酸21から747を選択した。融合タンパク質は、バルスタ…

Representative Results

クローニングとテスト式 めっきが適切に行われると、単一の単離されたコロニーをクローン形質転換された細菌細胞（ 図2A）プラッキングの可能性を高めるために形成すべきである。あまりにも多くの細胞を播種する場合は、プレートを37℃以下で変態が長すぎるインキュベートし、コロニーを寒天プレートを被覆または細胞の大きな凝集?…

Discussion

組換えタンパク質工学は多くの分野にまたがる非常に強力な技術である。これは、カスタム設計のタンパク質の高収量の産生を可能にする、費用対効果の高い、調整可能な比較的簡単な手順である。これは、設計および標的タンパク質を発現することは必ずしも容易ではないことに留意することが重要である。基底発現および組換えタンパク質の安定性を、ベクターの特定の選択に依存E.?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、この仕事をサポートして資金調達のためにアクロン大学を承認したいと思います。

Materials

1,4-dithio–DL-threitol, DTT, 99.5% Chem-Impex International 127 100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol Chem-Impex International 642 250 ml
Acetic acid, glacial EMD AX0073-9 2.5 L
Agar Bioshop AGR001.500 500 g
Ampicillin sodium salt  Sigma-Aldrich A9518 25 g
Antifoam 204 Sigma-Aldrich A6426 500 g
Barstar-NGF pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 1 ml; Expression Host
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916 500 ml
BugBuster Novagen 70922-3 100 ml
Gel filtration standard Bio-Rad 151-1901 6 vials
Glycerol Bioshop GLY001.1 1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride Chem-Impex International 152 1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88222 100 ml
Hydrochloric acid EMD  HX0603-3 2.5 L
Imidazole  Chem-Impex International 418 250 g
IPTG Chem-Impex International 194 100 g
Laemmli sample buffer Bio-Rad 161-0737 30 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface Chem-Impex International 270 500 g
LB Broth   Sigma-Aldrich L3022 1 kg
NovaBlue Competent Cells Novagen 69825 1 ml; Cloning Host
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK 10 pack
Potassium Chloride Chem-Impex International 01247 1 kg
Sema3A-pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 1 L
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886-1KG 1 kg
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-500 500 g
Sodium phosphate diabasic Sigma-Aldrich S5136-500G 500 g
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S5011 500 g
Terrific Broth Bioshop TER409.5 5 kg
Tetracycline hydrochloride Chem-Impex International 667 25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X Bio-Rad 1610732 1 L
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503 1 kg
Tryptone, pancreatic EMD 1.07213.1000 1 kg
Yeast extract, granulated EMD 1.03753.0500 500 g
Name of Kits/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
 ÄKTApurifier10 GE Healthcare 28-4062-64  Includes kits and accessories
Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000 MAXQ 4000
BirA500 Avidity BirA500 Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis Casette Thermo Scientific 66380 Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories  132127, 132129 MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923 GE Healthcare 11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit Invitrogen 1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C GE Healthcare 18-6083-13
Fraction Collector Frac-950 GE Healthcare 18-6083-00 Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator  VWR 13271-102 Model 1156D
Heating Oven FD Series Binder Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg GE Healthcare 17-1069-01 Discontinued–Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge Beckman Coulter 393126
JA 25.50 Rotor Beckman Coulter 363055
JLA 8.1 Rotor Beckman Coulter 969329 Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 Rotor Beckman Coulter 368690
Laminar Flow Hood Themo Scientific 1849 Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader TECAN infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8004 4-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels Bio-Rad 456-9036 Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA Column Bio-Rad 737-2512 49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit OMEGA bio-tek D6943-01
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 164-5052 250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes VWR 3119-0050 50 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators Corning 431488, 431483  20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning Service GenScript USA Inc. Protein Services
Ultrasonic Processor  Cole-Parmer 18910445A Model CV18
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236 Model G560
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Referenzen

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McCormick, A. M., Jarmusik, N. A., Endrizzi, E. J., Leipzig, N. D. Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration. J. Vis. Exp. (83), e51295, doi:10.3791/51295 (2014).
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