Выделение стволовых клеток рака из образцов предстательной железы человека
Summary
Выделение стволовых клеток рака (ЦОК) непосредственно из тканей человека является необходимым условием для их биологической характеристике. Эта рукопись описывает методологию выделения CSCs простаты из тканей человека, а также обеспечивает советы по устранению неисправностей трудные шаги.
Abstract
Рак стволовых клеток (ЦОК) модель была значительно пересмотрена в течение последних двух десятилетий. В течение этого времени ОКК были определены и непосредственно выделены из тканей человека и последовательно передаются в иммунодефицитных мышей, как правило, с помощью маркировки антител субпопуляций клеток и фракционирование с помощью проточной цитометрии. Тем не менее, уникальные клинические особенности рака простаты значительно ограничили изучение CSCs простаты из свежих образцов опухолей человека. Недавно мы сообщили о выделении CSCs простаты непосредственно из тканей человека в силу их класса HLA I (HLAI)-отрицательной фенотипа. Раковые клетки простаты собирают из хирургических образцов и механически диссоциируют. Суспензию клеток генерируется и помечены с флуоресцентно сопряженных HLAI и стромальных антител. Субпопуляциях из HLAI-негативных клеток, наконец, выделяли с использованием проточного цитометра. Основным ограничением этого протокола является часто микроскопические и мультифокальный характерпервичный рак в простатэктомий. Тем не менее, отдельные CSCs жить простаты подходят для молекулярных характеристик и функциональной проверки по трансплантации в иммунодефицитных мышей.
Introduction
Внутриопухолевой неоднородность считается признаком рака 1. В самом деле, несколько механизмов внутриопухолевой неоднородности были описаны, в том числе генной мутации и взаимодействия с микросреды. Кроме того, некоторые виды рака могут содержать сотовый иерархию с субпопуляции стволовых клеток рака (ЦОК), который проявляет свойства опухоли-начала мощности и самообновления в серийных трансплантации анализов 2-5. Первоначально описано в гематологических 6, 7, молочной железы и мозга 8 злокачественных опухолей, CSCs также были изучены в рака простаты 9-12, а также других типов опухолей 2-5.
ОКК правило, считается сотовой доля в гетерогенной популяции 2-5. Поэтому функционал и молекулярная характеристика CSCs будет присвоен после их обогащения от массовых групп населения. Соответственно, в течение последних двух десятилетий несколько встретилисьhodologies из CSC обогащения были разработаны которые обычно включают разделение меченых популяциях с помощью проточной цитометрии. Кроме того, значительное внимание при изучении CSCs в том, что иерархическая организация тканях человека могут быть нарушены экспериментальных манипуляций, таких как Серийные пассажи в культуре или иммунодефицитных мышей. В результате прямого изоляция CSCs из тканей человека стала важной методикой в области CSC.
Рак предстательной железы является одной из ведущих причин заболеваемости раком и смертности в Соединенных Штатах и во всем мире 13. Таким образом, изоляция и биологическая характеристика CSCs простаты представляет значительный интерес. Простата CSCs ранее обогатилась из клеточных линий, пациентов получены ксенотрансплантаты и низкий прохода пациента происходит суспензионных культур 9,10,12,14.
Недавно мы сообщили о выделении CSCs простаты непосредственно от хирургических с человеканые примеры в силу их HLAI-отрицательных клеточной поверхности фенотипа 10. Здесь мы подробно процедуры, осуществляемые для выделения этих клеток. Опухоли простаты собирают из хирургических образцов и сделал в клеточных суспензий. Затем клетки окрашивали с использованием антител против HLAI а также стромальных и жизнеспособность маркеры, и ОКК выделяли с активацией флуоресценции сортировки клеток (FACS). Изолированные CSCs затем могут быть использованы для анализов, требующих жизнеспособных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывается изоляция CSCs из свежих раковых тканей простаты человека. Несколько важных соображения влияют на успешный исход этого протокола.
Восстановление большого числа жизнеспособных клеток рака простаты зависит от тщательного валового оценки хирурги…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Харири Family Foundation и TJ Martell Foundation.
Materials
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning cell gro | 21-031-CM | |
| 60 mm-15 mm cell culture dish | Corning | 3295 | |
| 35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml conial tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 ml conical tune | Crystalgen | 23-2265 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| HLA class I (W6/32) PE antibody | Abcam | ab43545 | |
| CD31 FITC antibody | ebioscience | 11-0319-42 | |
| CD45 FITC antibody | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ PE antibody | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ FITC antibody | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| 12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
| Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| 10% Neutral Buffer Formalin | Fisher | RBBP-0480 |
Referenzen
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Magee, J. A., Piskounova, E., Morrison, S. J. Cancer stem cells: impact, heterogeneity, and uncertainty. Cancer Cell. 21, 283-296 (2012).
- Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat. Rev. Cancer. 12, 133-143 (2012).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat. Rev. Cancer. 12, 767-775 (2012).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell Stem Cell. 10, 717-728 (2012).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645-648 (1994).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65, 10946-10951 (2005).
- Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer Cell. 22, 373-388 (2012).
- Patrawala, L., Calhoun-Davis, T., Schneider-Broussard, R., Tang, D. G. Hierarchical organization of prostate cancer cells in xenograft tumors: the CD44+alpha2beta1+ cell population is enriched in tumor-initiating cells. Cancer Res. 67, 6796-6805 (2007).
- Qin, J., et al. The PSA(-/lo) prostate cancer cell population harbors self-renewing long-term tumor-propagating cells that resist castration. Cell Stem Cell. 10, 556-569 (2012).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2013. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Patrawala, L., et al. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
