Voorbereiding van de Primaire Myogene Precursor Cell / myoblast Culturen van Basal gewervelde Geslachten

Summary

In vitro cultuur systemen onmisbaar voor ons begrip van gewervelde myogenese bewezen. Er moet echter nog veel te leren over nonmammalian skeletspieren ontwikkeling en groei, met name in de basale taxa. Een efficiënte en robuuste protocol voor isolatie van de volwassen stamcellen van dit weefsel, de myogene voorlopercellen (MTR), en met behoud van hun zelf-vernieuwing, proliferatie en differentiatie in een primaire kweek instelling maakt de identificatie van geconserveerde en afwijkende regelmechanismen gedurende de gewervelde geslachten.

Abstract

Vanwege de inherente moeilijkheden en tijd die met het bestuderen van de myogene programma in vivo primaire kweek toepassen die van een bewoner volwassen stamcellen van skeletspieren, de myogene voorlopercellen (MPL) zijn onmisbaar voor ons begrip van zoogdierlijke skeletspieren ontwikkeling bewezen groei. Vooral onder de basale taxa van Vertebrata echter gegevens zijn beperkt beschrijven van de moleculaire mechanismen die de zelf-vernieuwing, proliferatie en differentiatie van de mediterrane partnerlanden. Van bijzonder belang zijn mogelijke mechanismen die het vermogen van basale gewervelde dieren aanzienlijke postlarval skelet myofiber hyperplasie (dwz beenvissen) en volledige regeneratie ondergaan volgende aanhangsel verlies (dwz urodele amfibieën) ten grondslag liggen. Daarnaast kan het gebruik van gekweekte myoblasts helpen bij het begrijpen van de wedergeboorte en de reprise van het myogene programma en de verschillen tussen hen. AanDaartoe hebben we in detail een robuust en efficiënt protocol (en variaties daarin) voor het isoleren en onderhouden MTR en hun nageslacht, myoblasten en onvolwassen myotubes in celkweek als platform voor het begrijpen van de evolutie van het myogene programma, beginnend met meer basale vertebraten. Voortbouwend op het modelorganisme status van de zebravis (Danio rerio), rapporteren we over de toepassing van dit protocol om kleine vissen van de karperachtigen clade Danioninae. In tandem, kan dit protocol worden gebruikt om een bredere vergelijkende benadering te realiseren door het isoleren van de mediterrane partnerlanden van de Mexicaanse axolotl (Ambystomamexicanum) en zelfs knaagdieren. Dit protocol wordt nu op grote schaal gebruikt in het bestuderen myogenesis in verschillende vissoorten, waaronder regenboogforel, zalm, en zeebrasem ^1-4.

Introduction

Aanzienlijke kennis van zoogdieren myogenesis is verkregen door de reprise van dit proces in zowel primaire muis (Mus musculus) myoblast culturen en de goed beschreven-muis afgeleide cellijn, C2C12 ^5. Beginnend in 1950 ^6, hebben deze culturen geleid tot veel vooruitgang in het inzicht in de murinemyogenic programma en daarmee, myogenese in andere vertebraten. Bovendien eencellige myofiber explantaat technieken begrijpen van de interacties tussen satelliet cellen en omliggende myovezels ^7-9 verhoogd uit. Celculturen worden bijzonder aantrekkelijk voor onderzoek van myogenese vanwege de korte tijd van precursor gedifferentieerde cel ^10, relatieve gemak van transfectie van RNAi ^11-14, transgene ^15,16 en overexpressie ^14,17,18 studies, in vitro expansie, gevolgd door in vivo implantatie ^18-20, en zelfs compArison van myogene voorloper cellen en hun regulerende agenten verspreid over taxa ^21,22. Hoewel verschillen vanwege de kunstmatige omgeving van het kweeksysteem beschreven ^5,23, hebben deze in vitro systemen bewezen onmisbaar onze dissectie van de ingewikkelde programma voor de vorming van meerkernige worden, terminaal gedifferentieerde myofibersfrom mononucleaire proliferatieve progenitorcellen bekend als myosatellite cellen (MSC) van de zoogdieren.

Buiten de klasse Mammalia, echter, het behoud en / of de divergentie van mechanismen die de myogenesis zijn slecht begrepen, grotendeels te wijten aan de moeilijkheid in het kweken van myogene voorloper cellen (MTR) en myoblasts uit verschillende taxa. Inderdaad, primaire myoblast alleen culturen beschreven in drie vogels ^24-26, een reptiel ^27, een paar amfibieën ^28-30, en sommige vissen ^1,3,4,31-33. Continue myogene cellijnen van veanders dan knaagdieren ^34-36 rtebrates zijn nog zeldzamer, met de enige niet-zoogdieren myogene cellijn wordt afgeleid van de Japanse kwartel (Cortunix japonica), QM7 ^37. Ondanks vele pogingen tot immortalisatie, een teleost myogene cellijn blijft ongrijpbaar en een protocol voor efficiënte transfectie van deze cellen werd pas dit jaar ¹⁵ gepubliceerd. Zo helder en goed geoptimaliseerde protocollen voor het kweken van primaire MTR en myoblasten uit een verscheidenheid van gewervelde dieren zijn hard nodig om niet alleen verder onze kennis van de evolutie van het myogene programma uit te breiden, maar om de kracht van vergelijkende fysiologie in dienst om doorbraken te maken in de behandeling van menselijke skeletspier ziekten en aandoeningen.

Terwijl de literatuur bevat veel meldingen van MPC / myoblast isolatie ^38-49, is het gebruikelijk voor auteurs om de protocollen voor dergelijke isolaties beschrijven in het kort, vaak onvolledig, formaten. Verder is de meest leerzame protocollen reported zijn ontwikkeld voor muizen ^50-53, en sommige van deze beroepen op antilichaam selectie ^54,55 of fluorescentie transgenen ^56,57, waardoor deze protocollen onbruikbaar of onpraktisch binnenste niet-knaagdieren gebruikt door de spieren biologen. Met weinig bekend over piscine, amfibieën en reptielen myogenesis, een gedetailleerde en grondige protocol, beschreven met audiovisuele begeleiding en met bewezen efficiëntie in ver verwante soorten, zouden de meeste die aan de orde zijn.

Voor het eerst beschreven door Powell en collega's in 1989 ^58, werd de volgende protocol in eerste instantie ontwikkeld om MTR en myoblasts isoleren van zalmachtigen (namelijk, regenboogforel, Oncorhynchus mykiss, en Atlantische zalm, Salmo salar) en enkele grotere karperachtigen (dwz goudvis, Carassiusauratusauratus) . In 2000, Fauconneau en Paboeuf geoptimaliseerd een primaire myoblast cultuur voor regenboogforel ⁵⁹ en minoroptimizations made dat protocol bruikbaar in meerdere kleinere visjes van de Danioninae clade (zebravis, Danio rerio, en gigantische danio, Devario aequipinnatus) ³² als gevolg van de vele genetische tools beschikbaar voor zebravis werk en dus zijn naaste familieleden. Beenvissen aantrekkelijk organismen studie vanwege hun uiteenlopende groeistrategie (althans in de meeste soorten). Grote zalmachtigen, net als de meeste vissen, groeien van onbepaalde, met groeipotentieel bezitten die een asymptoot op de vervaldag, zelfs op hoge leeftijd ^60-62. In tegenstelling tot de zebravis, grote danionins zoals de reus danio ⁶³ en besnorde groei danio weergave mogelijkheden typisch voor beenvissen, het maken van hun directe nevenschikking een ideaal platform voor het begrijpen of MPC cellot keuze speelt een rol in de skeletspier hyperplasie versus hypertrofie.

Ook hebben we aangetoond dat dit protocol kan worden gebruikt met muizen en axolotl met relatief hoge cel opbrengst vi quateriliteit indices. Urodele salamanders, zoals de Mexicaanse axolotl (Ambystomamexicanum), beschikken over de opmerkelijke vermogen om weefsels te regenereren, met inbegrip van hele ledematen en staarten ^64-66. Deze eigenschap maakt deze amfibieën interessante modellen van de skeletspieren verspillen en veroudering. De hieronder beschreven protocol, kan een soortgelijke benadering worden uitgevoerd zoals is gedaan in vele vissoorten, waardoor een nog grotere vergelijkende context voor deze studies. Zoals velen echt vergelijkende biologen waarderen, de meest betekenisvolle vooruitgang in de fundamentele biologie en translationele medische biologie kan worden gemaakt wanneer de gegevens worden geanalyseerd binnen het breedste spectrum (hier, de gehele gewervelde lineage).

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle experimenten met gewervelde dieren hierin beschreven werd vooraf goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Alabama in Birmingham en is in overeenstemming met de door het Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health van de richtlijnen van de VS Department of Health and Human Services. 1. Voorbereiding voor Cultuur Bereid de basis medium als volgt: 9 mM NaHCO3 (1,51 g per …

Representative Results

Vierentwintig uur na het zaaien, myogene voorloper cellen (MTR) moet zichtbaar bevestigd aan de laminin substraat (zie de figuren 1a en 1d). Na het zaaien, cellen (MTR) stelt een spindel-achtige vorm, wijzen op dit type cel (figuur 1) en zijn MYOD1 + (figuur 2). In Danio soorten, MPCs lijken compacter met kleinere bipolaire processen dan doen MTR van Oncorhynchus en Salmo soorten te zijn. Echter, meer dan vier dagen van cultuu…

Discussion

Het myogene programma, in welke onderzochte species, kan het gemakkelijkst bestudeerd via een in vitro systeem. Inderdaad, na isolatie, myogene voorloper cellen (MTR) in vis of myosatellite cellen (MSC) in zoogdieren voer gemakkelijk deze sterk gereguleerde proces, waarbij de proliferatie, celcyclus terugtrekking, en terminale differentiatie van myoblasts en de fusie van die myoblasts in wording myotubes. Het algemene gebrek aan transgene gen reporter stammen van piscine soorten (met de mogelijke uitzondering v…

Materials

			Table 1. Detailed Reagent Information
Reagent	Company (Preferred v. Alternate)	Catalog Number (Preferred v. Alternate)	Quantity per Culture
γ-irradiated poly-L-lysine	Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)	P5899 (ICN19454405)	5 mg
DMEM (high glucose)	Sigma-Aldrich (cellgro)	MT-50-003-PB (D7777)	2 L
Laminin	BD Biosciences (Sigma-Aldrich)	CB-40232 (L2020)	1 mg
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP328-500 (S5761)	1.51 g
HEPES (C8H18N2O4S)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP310-1 (H6147)	9.53 g
Antibiotic/Antimycotic	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SV3007901 (A5955)	17-20 mL
Gentamicin Sulfate	Lonza (Sigma-Aldrich)	BW17-519Z (G1397)	2-3 mL
Donor Equine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007403 (H1270)	75 mL
Fetal Bovine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007103 (F2442)	25 mL
Collagenase (Type IV)	Worthington (Sigma-Aldrich)	LS004189 (C9891)	0.44 g
Trypsin (from Pancreas)	MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)	ICN15357125 (T5266)	1 g
			Table 2. Consumables, Tools and Equipment
Consumable	Tools	Equipment
Cell Culture Plates	Forceps (Coarse)	Serological Pipettor
Sterile 50 mL Conical Tubes	Forceps (Fine)	pH Meter
Laboratory Tape	Scalpel Handles	Chilling Incubator (Echotherm)
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems	Scalpel Blades (#10, #11)	Laminar Flow Hood
Water-repellant Autoclave Paper	Surgical Scissors	Vacuum Manifold
Serological Pipettes	Glass Petri Dishes	Microosmolality Meter
	12-16 G Cannulas with Luer Locks
			Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
Plate Size	cm^2 per Well	Poly-L-lysine*	Laminin**
6 well	9.5	1.6 mL	1
24 well	1.9	0.32	0.2
48 well	0.95	0.16	0.1
96 well	0.32	0.06	0.03
*0.1 mg/mL concentration	** 0.020 mg/mL concentration
			Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
Reagent	Isolation	Wash	Dissociation	Complete
Base Medium	419.25 mL	395.40 mL	297.00 mL	178.00 mL
PSF*	5.00 mL	4.00 mL	3.00 mL	2.00 mL
Gentamicin Sulfate**	0.75 mL	0.60 mL	–	–
Donor Equine Serum	75.00 mL	–	–	–
Fetal Bovine Serum***	–	–	–	20.00 mL
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
			Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
Plate Size	cm^2 per Well	Dilution	Plating Volume
6 well	9.5	1.5-2.0×10^6 cells/mL	1 mL
24 well	1.9	1.5-2.0×10^6 cells/mL	250 μL
48 well	0.95	1.5-2.0×10^6 cells/mL	150 μL
96 well	0.32	1.5-2.0×10^6 cells/mL	50-100 μL
			Table 6. Average number of cells per g tissue
Species		Average # cells/g tissue
Danio rerio		6,400,000
Danio dangila		1,783,000
Devario aequipinnatus		1,797,000
Oncorhynchus mykiss		66,800
			Table 7. Recommended Incubation Temperatures
Species		Temperature
Danio/ Devario spp.		26 – 28 °C
Oncorhynchus/Salmo spp.		10* – 18 °C
Ambystoma mexicanum		18°C
* Lower temperatures support lower proliferation rates.