La coltura in vitro di sistemi si sono dimostrati indispensabili per la nostra comprensione di myogenesis vertebrati. Tuttavia, resta ancora molto da imparare su nonmammalian sviluppo muscolo scheletrico e la crescita, in particolare in taxa basali. Un protocollo efficiente e robusto per isolare le cellule staminali di questo tessuto, le cellule precursori miogenici (PPM), e mantenendo la loro auto-rinnovo, proliferazione e differenziazione in un ambiente coltura primaria consente l'identificazione di meccanismi di regolazione conservati e divergenti tutta i lignaggi vertebrati.
A causa della difficoltà intrinseca e ora coinvolto con lo studio del programma miogenico in vivo, sistemi di coltura primarie derivate da cellule staminali adulte residenti del muscolo scheletrico, le cellule precursori mioblaste (PPM), si sono rivelati indispensabili per la nostra comprensione dello sviluppo dei mammiferi muscolo scheletrico e crescita. Soprattutto tra i taxa basali di vertebrati, tuttavia, i dati sono limitati descrive i meccanismi molecolari che controllano l'auto-rinnovamento, la proliferazione e la differenziazione di PPM. Di particolare interesse sono i potenziali meccanismi che sottendono la capacità dei vertebrati basali a subire notevoli postlarval scheletrico myofiber iperplasia (cioè i pesci teleostei) e piena rigenerazione in seguito alla perdita appendice (cioè urodèle anfibi). Inoltre, l'utilizzo dei mioblasti in coltura potrebbe aiutare nella comprensione della rigenerazione e la ripresa del programma miogenico e le differenze tra loro. Atal fine, si descrive nel dettaglio un protocollo robusto ed efficiente (e le variazioni in esso) per isolare e mantenere PPM e la loro progenie, mioblasti e miotubi immaturi, in coltura cellulare come piattaforma per comprendere l'evoluzione del programma miogenico, a cominciare dal più vertebrati basali. Sfruttando il modello di status organismo del pesce zebra (Danio rerio), si segnala l'applicazione di questo protocollo per piccoli pesci del clade ciprinidi Danioninae. In tandem, questo protocollo può essere utilizzato per realizzare un approccio comparativo più ampio isolando PPM dal axolotl messicano (Ambystomamexicanum) e anche roditori da laboratorio. Questo protocollo è ora ampiamente utilizzato nello studio myogenesis in diverse specie di pesci, tra cui la trota iridea, salmone e orate 1-4.
Notevole comprensione della miogenesi mammiferi è stato ottenuto attraverso la ricapitolazione di questo processo in entrambe mouse principale (Mus musculus) culture mioblasti e la linea cellulare derivata da topo ben descritto, C2C12 5. A partire dal 1950 6, queste culture hanno portato a molto progresso nella comprensione del programma murinemyogenic e, per estensione, miogenesi in altri vertebrati. Inoltre, monocellulari tecniche myofiber espianto hanno aumentato fuori comprensione delle interazioni tra le cellule satelliti e fibre muscolari che circondano 7-9. Colture cellulari sono particolarmente interessanti per le indagini di myogenesis a causa del poco tempo da precursore delle cellule differenziate 10, relativa facilità di trasfezione per RNAi 11-14, transgenici 15,16 e iperespressione studi 14,17,18, l'espansione in vitro seguita da trapianto in vivo 18-20, e anche compArison di cellule precursori miogeniche e ai loro agenti di regolazione tutta taxa 21,22. Mentre le differenze dovute all'ambiente artificiale del sistema di coltura sono stati descritti 5,23, questi sistemi in vitro hanno dimostrato di essere indispensabile al nostro dissezione del programma intricato regolamentano la formazione di multinucleate, myofibersfrom terminalmente differenziate mononucleate cellule progenitrici proliferative conosciuti come myosatellite cellule (MSC) tra i mammiferi.
Al di fuori della classe Mammalia, tuttavia, la conservazione e / o divergenza di meccanismi che controllano myogenesis sono capiti male, soprattutto a causa della difficoltà di coltura di cellule precursori mioblaste (PPM) e mioblasti da diversi taxa. Infatti, colture primarie di mioblasti sono stati descritti solo in tre uccelli 24-26, un rettile 27, un paio di anfibi 28-30, e alcuni pesci 1,3,4,31-33. Linee cellulari continue miogeniche da vertebrates diversi roditori 34-36 sono ancora più rari, con l'unica linea non-mammiferi miogenico delle cellule essendo derivata da quaglia giapponese (Cortunix japonica), QM7 37. Nonostante i molti tentativi di immortalization, una linea cellulare miogenico teleosteo rimane sfuggente e un protocollo per la trasfezione efficiente di queste cellule è stato pubblicato solo quest'anno 15. Quindi, sono molto necessari protocolli chiari e ben ottimizzato per la coltura PPM primari e mioblasti da una varietà di vertebrati, non solo per espandere ulteriormente la nostra conoscenza dell'evoluzione del programma miogenico, ma di utilizzare il potere della fisiologia comparata a fare progressi in il trattamento di malattie muscolari scheletriche ei disturbi umani.
Mentre la letteratura contiene molte segnalazioni di MPC / mioblasti isolamento 38-49, è comune per gli autori per descrivere i protocolli per tali isolamenti in breve, spesso incompleti, formati. Inoltre, i protocolli più istruttivi pronti contro termineVALIDITA sono stati sviluppati per i topi 50-53, e alcuni di questi contare su selezione di anticorpi 54,55 o transgeni fluorescenza 56,57, rendendo questi protocolli inutilizzabile o impraticabili intimi specie di non roditori utilizzati dai biologi muscolari. Con poco conosciuto su piscine, anfibi, rettili e miogenesi, un protocollo dettagliato e approfondito, descritta con una guida audiovisiva e con efficienza dimostrata in specie lontanamente imparentati, sarebbe più utile per il campo.
In primo luogo descritto da Powell e colleghi nel 1989 58, il seguente protocollo è stato inizialmente sviluppato per isolare PPM e mioblasti da pesci salmonidi (vale a dire, trota iridea, Oncorhynchus mykiss, e salmone atlantico, Salmo salar) e alcuni ciprinidi più grandi (ad esempio pesci rossi, Carassiusauratusauratus) . Nel 2000, Fauconneau e Paboeuf ottimizzati una cultura mioblasti primario per la trota iridea 59, e minoroptimizations made che il protocollo utilizzabile in diversi pesciolini piccoli del clade Danioninae (zebrafish, Danio rerio, e Danio giganti, Devario Aequipinnatus) 32 a causa dei molti strumenti genetici disponibili per il lavoro zebrafish e quindi i suoi parenti stretti. Pesci teleostei sono organismi interessanti per lo studio a causa della loro strategia di crescita divergente (almeno nella maggior parte delle specie). Grandi salmonidi, come la maggior parte dei pesci, crescono indeterminato, con un potenziale di crescita illimitato da parte di un asintoto alla scadenza, anche in età 60-62. A differenza di zebrafish, grandi danionins come il danio gigante 63 e potenziali di crescita visualizzazione Danio baffuti tipici dei pesci teleostei, rendendo la loro diretta giustapposizione una piattaforma ideale per capire se la scelta del destino cellulare MPC svolge un ruolo nella iperplasia muscolo scheletrico contro l'ipertrofia.
Allo stesso modo, abbiamo dimostrato che questo protocollo può essere utilizzato con topi e axolotl, con rendimento relativamente elevato cellulare e viabindici ility. Salamandre urodèle, come l'axolotl messicano (Ambystomamexicanum), possiedono la straordinaria capacità di rigenerare i tessuti, anche di interi arti e code di 64-66. Questa caratteristica rende questi anfibi interessanti modelli di atrofia muscolare scheletrico e l'invecchiamento. Utilizzando il protocollo descritto di seguito, un approccio simile può essere effettuata come è stato fatto in molte specie di pesce, fornendo un contesto comparativo ancora più ampia per tali studi. Come molti biologi veramente apprezzare comparativi, i progressi più significativi nel campo della biologia di base e traslazionale biomedicina possono essere fatte quando i dati vengono analizzati all'interno dello spettro più ampio (qui, l'intera stirpe dei vertebrati).
Il programma miogenico, in qualsiasi specie esaminate, può essere più facilmente studiata attraverso un sistema in vitro. Infatti, sull'isolamento, cellule precursori miogenici (PPM) in pesci o cellule myosatellite (MSC) nei mammiferi facilmente entrare in questo processo altamente regolato che coinvolge la proliferazione, ritiro ciclo cellulare e differenziazione terminale dei mioblasti e la fusione di questi mioblasti in miotubi nascenti. La generale mancanza di ceppi transgenici gene reporter di specie…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano estendere molte grazie al Drs. Josep Planas e Juan Castillo per le loro competenze professionali per lo sviluppo e l'applicazione di questo protocollo cultura di piccoli pesci e anfibi. Un ringraziamento anche a causa delle innumerevoli persone che hanno instancabilmente assistito con la dissezione e la dissociazione del tessuto muscolare da molti pesci (sia nelle specie e numero), tra cui Matthew ricarica, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily, e Sinibaldo Romero. Questo lavoro è stato sostenuto da University of Alabama a Birmingham Dipartimento di fondi di start-up Biologia, Centro per la Ricerca proteasi NIH di Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS di Grant # R03AR055350, e NDSU Advance AVANTI NSF di Grant # HRD-0.811.239 di PRB. Il sostegno è stato fornito anche dalla UAB Nutrition Obesity Research Center di aggiudicazione # P30DK056336, NIH NIDDK. Suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamenterappresentano la posizione ufficiale del NIH.
Table 1. Detailed Reagent Information | ||||
Reagent | Company (Preferred v. Alternate) | Catalog Number (Preferred v. Alternate) | Quantity per Culture | |
γ-irradiated poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg | |
DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich (cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L | |
Laminin | BD Biosciences (Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1.51 g | |
HEPES (C8H18N2O4S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9.53 g | |
Antibiotic/Antimycotic | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17-20 mL | |
Gentamicin Sulfate | Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 mL | |
Donor Equine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 mL | |
Fetal Bovine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 mL | |
Collagenase (Type IV) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0.44 g | |
Trypsin (from Pancreas) | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g | |
Table 2. Consumables, Tools and Equipment | ||||
Consumable | Tools | Equipment | ||
Cell Culture Plates | Forceps (Coarse) | Serological Pipettor | ||
Sterile 50 mL Conical Tubes | Forceps (Fine) | pH Meter | ||
Laboratory Tape | Scalpel Handles | Chilling Incubator (Echotherm) | ||
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems | Scalpel Blades (#10, #11) | Laminar Flow Hood | ||
Water-repellant Autoclave Paper | Surgical Scissors | Vacuum Manifold | ||
Serological Pipettes | Glass Petri Dishes | Microosmolality Meter | ||
12-16 G Cannulas with Luer Locks | ||||
Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates | ||||
Plate Size | cm^2 per Well | Poly-L-lysine* | Laminin** | |
6 well | 9.5 | 1.6 mL | 1 | |
24 well | 1.9 | 0.32 | 0.2 | |
48 well | 0.95 | 0.16 | 0.1 | |
96 well | 0.32 | 0.06 | 0.03 | |
*0.1 mg/mL concentration | ** 0.020 mg/mL concentration | |||
Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture | ||||
Reagent | Isolation | Wash | Dissociation | Complete |
Base Medium | 419.25 mL | 395.40 mL | 297.00 mL | 178.00 mL |
PSF* | 5.00 mL | 4.00 mL | 3.00 mL | 2.00 mL |
Gentamicin Sulfate** | 0.75 mL | 0.60 mL | – | – |
Donor Equine Serum | 75.00 mL | – | – | – |
Fetal Bovine Serum*** | – | – | – | 20.00 mL |
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized | ||||
Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes | ||||
Plate Size | cm^2 per Well | Dilution | Plating Volume | |
6 well | 9.5 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 1 mL | |
24 well | 1.9 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 250 μL | |
48 well | 0.95 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 150 μL | |
96 well | 0.32 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 50-100 μL | |
Table 6. Average number of cells per g tissue | ||||
Species | Average # cells/g tissue | |||
Danio rerio | 6,400,000 | |||
Danio dangila | 1,783,000 | |||
Devario aequipinnatus | 1,797,000 | |||
Oncorhynchus mykiss | 66,800 | |||
Table 7. Recommended Incubation Temperatures | ||||
Species | Temperature | |||
Danio/ Devario spp. | 26 – 28 °C | |||
Oncorhynchus/Salmo spp. | 10* – 18 °C | |||
Ambystoma mexicanum | 18°C | |||
* Lower temperatures support lower proliferation rates. |