Preparazione di primaria Miogenica precursori cellulari / Culture mioblasti dal basale vertebrati Lignaggi

Summary

La coltura in vitro di sistemi si sono dimostrati indispensabili per la nostra comprensione di myogenesis vertebrati. Tuttavia, resta ancora molto da imparare su nonmammalian sviluppo muscolo scheletrico e la crescita, in particolare in taxa basali. Un protocollo efficiente e robusto per isolare le cellule staminali di questo tessuto, le cellule precursori miogenici (PPM), e mantenendo la loro auto-rinnovo, proliferazione e differenziazione in un ambiente coltura primaria consente l'identificazione di meccanismi di regolazione conservati e divergenti tutta i lignaggi vertebrati.

Abstract

A causa della difficoltà intrinseca e ora coinvolto con lo studio del programma miogenico in vivo, sistemi di coltura primarie derivate da cellule staminali adulte residenti del muscolo scheletrico, le cellule precursori mioblaste (PPM), si sono rivelati indispensabili per la nostra comprensione dello sviluppo dei mammiferi muscolo scheletrico e crescita. Soprattutto tra i taxa basali di vertebrati, tuttavia, i dati sono limitati descrive i meccanismi molecolari che controllano l'auto-rinnovamento, la proliferazione e la differenziazione di PPM. Di particolare interesse sono i potenziali meccanismi che sottendono la capacità dei vertebrati basali a subire notevoli postlarval scheletrico myofiber iperplasia (cioè i pesci teleostei) e piena rigenerazione in seguito alla perdita appendice (cioè urodèle anfibi). Inoltre, l'utilizzo dei mioblasti in coltura potrebbe aiutare nella comprensione della rigenerazione e la ripresa del programma miogenico e le differenze tra loro. Atal fine, si descrive nel dettaglio un protocollo robusto ed efficiente (e le variazioni in esso) per isolare e mantenere PPM e la loro progenie, mioblasti e miotubi immaturi, in coltura cellulare come piattaforma per comprendere l'evoluzione del programma miogenico, a cominciare dal più vertebrati basali. Sfruttando il modello di status organismo del pesce zebra (Danio rerio), si segnala l'applicazione di questo protocollo per piccoli pesci del clade ciprinidi Danioninae. In tandem, questo protocollo può essere utilizzato per realizzare un approccio comparativo più ampio isolando PPM dal axolotl messicano (Ambystomamexicanum) e anche roditori da laboratorio. Questo protocollo è ora ampiamente utilizzato nello studio myogenesis in diverse specie di pesci, tra cui la trota iridea, salmone e orate ^1-4.

Introduction

Notevole comprensione della miogenesi mammiferi è stato ottenuto attraverso la ricapitolazione di questo processo in entrambe mouse principale (Mus musculus) culture mioblasti e la linea cellulare derivata da topo ben descritto, C2C12 ^5. A partire dal 1950 ^6, queste culture hanno portato a molto progresso nella comprensione del programma murinemyogenic e, per estensione, miogenesi in altri vertebrati. Inoltre, monocellulari tecniche myofiber espianto hanno aumentato fuori comprensione delle interazioni tra le cellule satelliti e fibre muscolari che circondano ^7-9. Colture cellulari sono particolarmente interessanti per le indagini di myogenesis a causa del poco tempo da precursore delle cellule differenziate ^10, relativa facilità di trasfezione per RNAi ^11-14, transgenici ^15,16 e iperespressione studi ^14,17,18, l'espansione in vitro seguita da trapianto in vivo ^18-20, e anche compArison di cellule precursori miogeniche e ai loro agenti di regolazione tutta taxa ^21,22. Mentre le differenze dovute all'ambiente artificiale del sistema di coltura sono stati descritti ^5,23, questi sistemi in vitro hanno dimostrato di essere indispensabile al nostro dissezione del programma intricato regolamentano la formazione di multinucleate, myofibersfrom terminalmente differenziate mononucleate cellule progenitrici proliferative conosciuti come myosatellite cellule (MSC) tra i mammiferi.

Al di fuori della classe Mammalia, tuttavia, la conservazione e / o divergenza di meccanismi che controllano myogenesis sono capiti male, soprattutto a causa della difficoltà di coltura di cellule precursori mioblaste (PPM) e mioblasti da diversi taxa. Infatti, colture primarie di mioblasti sono stati descritti solo in tre uccelli ^24-26, un rettile ^27, un paio di anfibi ^28-30, e alcuni pesci ^1,3,4,31-33. Linee cellulari continue miogeniche da vertebrates diversi roditori ^34-36 sono ancora più rari, con l'unica linea non-mammiferi miogenico delle cellule essendo derivata da quaglia giapponese (Cortunix japonica), QM7 ^37. Nonostante i molti tentativi di immortalization, una linea cellulare miogenico teleosteo rimane sfuggente e un protocollo per la trasfezione efficiente di queste cellule è stato pubblicato solo quest'anno ^15. Quindi, sono molto necessari protocolli chiari e ben ottimizzato per la coltura PPM primari e mioblasti da una varietà di vertebrati, non solo per espandere ulteriormente la nostra conoscenza dell'evoluzione del programma miogenico, ma di utilizzare il potere della fisiologia comparata a fare progressi in il trattamento di malattie muscolari scheletriche ei disturbi umani.

Mentre la letteratura contiene molte segnalazioni di MPC / mioblasti isolamento ^38-49, è comune per gli autori per descrivere i protocolli per tali isolamenti in breve, spesso incompleti, formati. Inoltre, i protocolli più istruttivi pronti contro termineVALIDITA sono stati sviluppati per i topi ^50-53, e alcuni di questi contare su selezione di anticorpi ^54,55 o transgeni fluorescenza ^56,57, rendendo questi protocolli inutilizzabile o impraticabili intimi specie di non roditori utilizzati dai biologi muscolari. Con poco conosciuto su piscine, anfibi, rettili e miogenesi, un protocollo dettagliato e approfondito, descritta con una guida audiovisiva e con efficienza dimostrata in specie lontanamente imparentati, sarebbe più utile per il campo.

In primo luogo descritto da Powell e colleghi nel 1989 ^58, il seguente protocollo è stato inizialmente sviluppato per isolare PPM e mioblasti da pesci salmonidi (vale a dire, trota iridea, Oncorhynchus mykiss, e salmone atlantico, Salmo salar) e alcuni ciprinidi più grandi (ad esempio pesci rossi, Carassiusauratusauratus) . Nel 2000, Fauconneau e Paboeuf ottimizzati una cultura mioblasti primario per la trota iridea ^59, e minoroptimizations made che il protocollo utilizzabile in diversi pesciolini piccoli del clade Danioninae (zebrafish, Danio rerio, e Danio giganti, Devario Aequipinnatus) ³² a causa dei molti strumenti genetici disponibili per il lavoro zebrafish e quindi i suoi parenti stretti. Pesci teleostei sono organismi interessanti per lo studio a causa della loro strategia di crescita divergente (almeno nella maggior parte delle specie). Grandi salmonidi, come la maggior parte dei pesci, crescono indeterminato, con un potenziale di crescita illimitato da parte di un asintoto alla scadenza, anche in età ^60-62. A differenza di zebrafish, grandi danionins come il danio gigante ⁶³ e potenziali di crescita visualizzazione Danio baffuti tipici dei pesci teleostei, rendendo la loro diretta giustapposizione una piattaforma ideale per capire se la scelta del destino cellulare MPC svolge un ruolo nella iperplasia muscolo scheletrico contro l'ipertrofia.

Allo stesso modo, abbiamo dimostrato che questo protocollo può essere utilizzato con topi e axolotl, con rendimento relativamente elevato cellulare e viabindici ility. Salamandre urodèle, come l'axolotl messicano (Ambystomamexicanum), possiedono la straordinaria capacità di rigenerare i tessuti, anche di interi arti e code di ^64-66. Questa caratteristica rende questi anfibi interessanti modelli di atrofia muscolare scheletrico e l'invecchiamento. Utilizzando il protocollo descritto di seguito, un approccio simile può essere effettuata come è stato fatto in molte specie di pesce, fornendo un contesto comparativo ancora più ampia per tali studi. Come molti biologi veramente apprezzare comparativi, i progressi più significativi nel campo della biologia di base e traslazionale biomedicina possono essere fatte quando i dati vengono analizzati all'interno dello spettro più ampio (qui, l'intera stirpe dei vertebrati).

Protocol

Etica Dichiarazione: Tutti sperimentazione sugli animali vertebrati qui descritti è stato approvato in via preliminare dal Comitato Istituzionale cura degli animali e uso della University of Alabama a Birmingham ed è coerente con le linee guida stabilite dal Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health degli Stati Uniti Dipartimento di Salute e Servizi Umani. 1. Preparazione per la Cultura Preparare il terreno base come segue: 9 mM NaHCO3</sub…

Representative Results

Ventiquattro ore dopo la semina, le cellule precursori miogeniche (PPM) devono essere visibili attaccato al substrato laminina (vedi figure 1a e 1d). Dopo la semina, le cellule (PPM) adottano una forma mandrino-like, indicativa di questo tipo di cellule (figura 1) e sono MyoD1 + (Figura 2). Nelle specie Danio, PPM sembrano essere più compatto, con piccoli processi bipolari che fanno PPM da Oncorhynchus e Salmo specie. Tuttavi…

Discussion

Il programma miogenico, in qualsiasi specie esaminate, può essere più facilmente studiata attraverso un sistema in vitro. Infatti, sull'isolamento, cellule precursori miogenici (PPM) in pesci o cellule myosatellite (MSC) nei mammiferi facilmente entrare in questo processo altamente regolato che coinvolge la proliferazione, ritiro ciclo cellulare e differenziazione terminale dei mioblasti e la fusione di questi mioblasti in miotubi nascenti. La generale mancanza di ceppi transgenici gene reporter di specie…

Materials

			Table 1. Detailed Reagent Information
Reagent	Company (Preferred v. Alternate)	Catalog Number (Preferred v. Alternate)	Quantity per Culture
γ-irradiated poly-L-lysine	Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)	P5899 (ICN19454405)	5 mg
DMEM (high glucose)	Sigma-Aldrich (cellgro)	MT-50-003-PB (D7777)	2 L
Laminin	BD Biosciences (Sigma-Aldrich)	CB-40232 (L2020)	1 mg
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP328-500 (S5761)	1.51 g
HEPES (C8H18N2O4S)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP310-1 (H6147)	9.53 g
Antibiotic/Antimycotic	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SV3007901 (A5955)	17-20 mL
Gentamicin Sulfate	Lonza (Sigma-Aldrich)	BW17-519Z (G1397)	2-3 mL
Donor Equine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007403 (H1270)	75 mL
Fetal Bovine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007103 (F2442)	25 mL
Collagenase (Type IV)	Worthington (Sigma-Aldrich)	LS004189 (C9891)	0.44 g
Trypsin (from Pancreas)	MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)	ICN15357125 (T5266)	1 g
			Table 2. Consumables, Tools and Equipment
Consumable	Tools	Equipment
Cell Culture Plates	Forceps (Coarse)	Serological Pipettor
Sterile 50 mL Conical Tubes	Forceps (Fine)	pH Meter
Laboratory Tape	Scalpel Handles	Chilling Incubator (Echotherm)
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems	Scalpel Blades (#10, #11)	Laminar Flow Hood
Water-repellant Autoclave Paper	Surgical Scissors	Vacuum Manifold
Serological Pipettes	Glass Petri Dishes	Microosmolality Meter
	12-16 G Cannulas with Luer Locks
			Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
Plate Size	cm^2 per Well	Poly-L-lysine*	Laminin**
6 well	9.5	1.6 mL	1
24 well	1.9	0.32	0.2
48 well	0.95	0.16	0.1
96 well	0.32	0.06	0.03
*0.1 mg/mL concentration	** 0.020 mg/mL concentration
			Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
Reagent	Isolation	Wash	Dissociation	Complete
Base Medium	419.25 mL	395.40 mL	297.00 mL	178.00 mL
PSF*	5.00 mL	4.00 mL	3.00 mL	2.00 mL
Gentamicin Sulfate**	0.75 mL	0.60 mL	–	–
Donor Equine Serum	75.00 mL	–	–	–
Fetal Bovine Serum***	–	–	–	20.00 mL
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
			Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
Plate Size	cm^2 per Well	Dilution	Plating Volume
6 well	9.5	1.5-2.0×10^6 cells/mL	1 mL
24 well	1.9	1.5-2.0×10^6 cells/mL	250 μL
48 well	0.95	1.5-2.0×10^6 cells/mL	150 μL
96 well	0.32	1.5-2.0×10^6 cells/mL	50-100 μL
			Table 6. Average number of cells per g tissue
Species		Average # cells/g tissue
Danio rerio		6,400,000
Danio dangila		1,783,000
Devario aequipinnatus		1,797,000
Oncorhynchus mykiss		66,800
			Table 7. Recommended Incubation Temperatures
Species		Temperature
Danio/ Devario spp.		26 – 28 °C
Oncorhynchus/Salmo spp.		10* – 18 °C
Ambystoma mexicanum		18°C
* Lower temperatures support lower proliferation rates.