애벌레 Zebrafish의 척수 절개
Summary
척추 절개 한 후, 성인 zebrafish의 육주 후 손상에 의한 기능 회복이있다. 유생의 투명성과 빠른 복구를 이용하려면, 우리는 애벌레 척수에 병행하는 방법을 제시한다. 절개 한 후, 우리는 3 일 후 부상으로 이일 후 상해에서 시작 감각 회복을 관찰하고 C-굴곡 운동.
Abstract
포유 동물에 의한 부상의 수준 이하로 축삭 재성장의 부족뿐만 아니라 척추 신경을 재개하는 무능력에 척수 손상을 다음과 감각과 운동 회복에 실패합니다. 그러나, 척수의 완전 절개 후 감각과 기능 회복을 모두 제브라 다니오의 rerio 전시 등 일부 anamniotes. 성인 zebrafish의 6 주 후 부상으로 감각과 운동 회복, 척수 손상 후 재생을 연구하기위한 설립 모델 생물이다. 투명 애벌레 제브라 피쉬에서 사용할 수있는 재생 과정의 생체 내 분석의 장점뿐만 아니라 성인의 유전 도구에 액세스 할 수 없습니다를 사용하려면, 우리는 척수를 절단 한 후 재생을 연구하는 애벌레 제브라 피쉬를 사용합니다. 여기에서 우리는 재생 가능하고 검증 가능한 애벌레 척수에 병행하는 방법을 보여줍니다. 절개 한 후, 우리의 데이터도 2 일 후 부상 수 (dpi)에 감각 복구 시작을 보여줍니다, 재치H 3 dpi로 5 dpi로 무료 수영의 재개에 의해 검출 C-굽힘 운동. 따라서 우리는 척수 손상 후 복구의 연구를위한 성인 제브라 피쉬에 동반자 도구로 애벌레 제브라 피쉬를 제안한다.
Introduction
인간의 척수에 큰 외상은 종종 인해 축삭을 자라게 또는 신경 1,2를 재개 할 수 없다는으로, 영구적 인 마비와 부상의 수준 이하로 감각의 손실이 발생합니다. 포유 동물과는 달리, 그러나, 도롱뇽과 제브라 피쉬 (다니오 rerio) 등의 anamniotes도 완전 척수 절개 3,4 후 강력한 회복을 보여줍니다.
성인 zebrafish의 척수 손상 5-7 다음 복구 프로세스를 연구하기위한 기초가 튼튼한 모델입니다. 완전 척수를 절단 한 다음, 감각 및 기관차 기능의 회복은 육주 후 부상 (8)에 의해 성인 제브라 피쉬에서 관찰된다. 생체 내 재생 과정을 조사하기 위해, 우리는 투명 유생 제브라 9 돌렸다.
여기서 우리는 오일 후 수정 (DPF) 애벌레 제브라 피쉬의 USI의 척수를 절개하는 방법을 제시한다밧의에서 수정 메스로 경 사진 미세 주입 피펫을,, 겨 등. 10이 방법은 높은 처리량, 낮은 사망률과 재현성을 지원합니다. 연습으로, 300 유생 / 시간은 가로로 할 수 있으며, 98.75 % 0.72 % ± 3,600 이상의 동물을 포함 transections 6 개월 이상, 7 일 후 부상 (dpi)로 될 때까지 살아 남았다. 우리의 데이터뿐만 아니라 감각과 운동의 빠른 회복을 보여줍니다 : 1 dpi로에서 부상당한 물고기의 모든 움직임은 가슴 지느러미 운동에 의해 구동된다. 그러나 애벌레 2 dpi로하여 절개에 바늘 터치 꼬리 텅스텐에 응답하기 시작, 3 dpi로하여 C-굽힘 운동을 다시 설정하고, 5 dpi로 (11)에 의해 약탈 수영을 표시합니다. 아세틸 튜 불린에 대한 항체 염색법을 사용하여, 우리는 축삭 1 dpi 해상도에서 부상 사이트에서없는 것을 확인했지만, 5 dpi로하여 부상 사이트를 넘었다. 우리는이 프로토콜은 다음과 같은 부상 척수에있는 축삭 재성장과 신경의 연구를위한 가치있는 기술을 제공 할 것입니다 믿습니다. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
처음에이 기술을 학습 할 때, 우리는 하나의 세션에서 더 이상 50 ~ 100 이상 transections을 시도하는 것이 좋습니다. 이 기술을 마스터 한 후, 우리는 시간 당 300 배아까지 절개 할 수있다; 그러나, 처리량이 수준의 주간 연습의 몇 개월을 필요로합니다. 우리는 또한 기자 라인을 연습하고 불완전 척수 절개의 빈도가 1 % 이하로 감소 될 때까지 완전 절개를 확인하는 것이 좋습니다.
…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 동물 사육에 대한 유타 대학의 제브라 피쉬의 시설에 빚이있다. RID는 NIH R56NS053897에서 지원하고, LKB는 HHMI 메드 – 속 – 대학원 사업에 의해 지원 predoctoral 연수생이었다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100mm petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 ga. needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20°C |
| micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1L) | store at RT | ||
| 17.5g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10ml) | make fresh, discard extra | ||
| 0.35g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1L) | store at RT | ||
| 50ml 20x E2 | |||
| 2ml fresh 500x NaCO3 |
Referenzen
- Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair. Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).
- Mikami, Y., et al. Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery. Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).
- Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).
- Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).
- Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).
- Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).
- Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish. The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish. PloS one. 7 (2), (2012).
- Kim, C. H., et al. Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation. Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).
