幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断
Summary
脊髄切断後、大人のゼブラフィッシュは、6週間後損傷によって機能回復を持っている。幼虫の透明性と迅速な復旧を活用するために、我々は、幼虫の脊髄を離断するための方法を提示する。切断後、我々は、3日後に傷害によって2日後の傷害、およびC-曲がり動きで始まる感覚の回復を観察します。
Abstract
哺乳類は軸索損傷のレベル以下の再成長だけでなく、脊髄神経発生を再開することができないことが不足しているため、脊髄損傷後の感覚と運動の回復に失敗します。しかし、脊髄の完全な切断後の感覚と機能回復の両方ゼブラフィッシュゼブラフィッシュの展示を含むいくつかのanamniotes。大人のゼブラフィッシュは、6週間後損傷によって感覚と運動の回復を、脊髄損傷後の再生を研究するための確立されたモデル生物である。透明幼虫ゼブラフィッシュで利用可能な再生過程のin vivo解析だけでなく、大人ではアクセスできません遺伝的なツールを活用するために、我々は脊髄切断後の再生を研究するため、幼虫のゼブラフィッシュを使用しています。ここでは、再現性と検証可能幼虫脊髄を離断するための方法を示しています。切断後、我々のデータは2日後損傷（DPI）から始まる感覚の回復を示しており、ウィット5解像度による自由遊泳の3解像度および再開によって検出可能なH C – 曲げ運動。したがって、私たちは、脊髄損傷後の回復の研究のための大人のゼブラフィッシュのコンパニオンツールとして幼虫のゼブラフィッシュを提案する。
Introduction
人間の脊髄への大きな外傷は、しばしば軸索を再成長や神経新生1,2を再開することができないことに、永続的な麻痺や損傷のレベル以下の感覚の損失をもたらす。哺乳類とは対照的に、しかし、サンショウウオやゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）を含むanamniotesでも、完全な脊髄切断の3,4の後に強固な回復を示している。
大人のゼブラフィッシュは、脊髄損傷の5-7次の回復過程を研究するための十分に確立されたモデルである。完全な脊髄切断後、感覚や機関車の機能の再構築は、損傷後8 6週間で成人のゼブラフィッシュで観察される。 インビボでの再生過程を調べるために、我々は、透明な幼虫のゼブラフィッシュ9になった。
ここでは、5日後に受精（DPF）幼虫ゼブラフィッシュUSIの脊髄を横断するための方法を提示バットから変更小刀などの面取りマイクロインジェクションピペットを、、Ng ら。10この方法は、高スループット、低死亡率、および再現性をサポートしています。練習すれば300幼虫/ HRは横に切開することができ、3600以上の動物を含む離断の6ヶ月間にわたって、0.72％±98.75パーセントは、7日間、損傷後（DPI）まで生存した。我々のデータは、同様に、感覚と運動の急速な回復を示しています。1 dpiで、負傷した魚にすべての動きだけ胸びれ運動によって駆動される。しかし、幼虫は、2解像度によって離断にタッチ尾針タングステンに反応する3解像度によるC曲げ運動を再確立し、5解像度11で捕食水泳を表示し始める。アセチル化チューブリンに対する抗体染色を用いて、我々は、軸索は1 dpiで損傷部位には存在しないことを確認したが、5解像度によって損傷部位を横断している。我々は、このプロトコルは、損傷後の脊髄における軸索再生および神経発生の研究のための貴重な技術を提供すると確信しています。 </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
当初はこの手法を学習するとき、我々は、単一のセッションにはもう50〜100以上の離断をしようとしてお勧めします。このテクニックをマスターした後、我々は時間当たり300胚まで横断することができます。しかし、スループットのレベルは、毎週の練習の数ヶ月を必要とします。また、レポーター線と練習および不完全脊髄切断の発生率が1％未満になるまで完全に離断を検証することをお?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、畜産用のユタ大学のゼブラフィッシュ施設にお世話になっている。 RIDは、NIH R56NS053897によってサポートされ、LKBはハワードヒューズマックイントゥ·グラッドイニシアティブでサポートされている博士号を取得する前の研修生だった。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100mm petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 ga. needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20°C |
| micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1L) | store at RT | ||
| 17.5g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10ml) | make fresh, discard extra | ||
| 0.35g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1L) | store at RT | ||
| 50ml 20x E2 | |||
| 2ml fresh 500x NaCO3 |
Referenzen
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