Gemodificeerd<em> In vitro</em> Invasion Assay naar de mogelijke rol van hormonen, cytokines en / of groeifactoren in Bemiddelen Cancer Cell Invasion Bepaal
Summary
This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.
Abstract
Bloedserum dient als een chemoattractant richting die kankercellen migreren en binnen te vallen, hun intravasation faciliteren in haarvaten. De werkelijke moleculen waarnaar het migreren blijven ongrijpbaar. Deze gewijzigde invasie assay ontwikkeld om doelstellingen die celmigratie en invasie drijven identificeren. Deze techniek vergelijkt de invasie index onder drie voorwaarden te bepalen of een specifiek hormoon, groeifactor of cytokine speelt een rol in het mediëren van het invasieve potentieel van een kankercel. Deze omvatten i) normaal foetaal runderserum (FBS), ii) houtskool gestript FBS (CS-FBS), die hormonen, groeifactoren en cytokinen en iii) CS-FBS + molecule verwijderd (aangeduid als "X"). Een significante wijziging invasie CS-FBS vergeleken met FBS, geeft de betrokkenheid van hormonen, cytokinen of groeifactoren de regulering van de verandering. Individuele moleculen kunnen vervolgens weer worden toegevoegd aan CS-FBS hun vermogen om opnieuw te testenvers of redden van de invasie fenotype. Verder kunnen twee of meer elementen worden gecombineerd om de additieve of synergetische effecten van meerdere moleculen in besturen of remmen invasie evalueren. Kortom, deze werkwijze kan de onderzoeker bepalen of hormonen, cytokinen en / of groeifactoren spelen een rol bij invasie door als chemoattractanten en remmers van inval voor een bepaald type kankercel of een bepaalde mutant. Door het identificeren van specifieke chemoattractants en remmers, kan deze gewijzigde invasie assay helpen verhelderen signaalwegen die kankercel invasie sturen.
Introduction
Een nieuw invasie assay is ontwikkeld met het doel van het identificeren van de betrokkenheid van specifieke hormonen, cytokinen en / of groeifactoren zoals chemoattractanten in kankercel invasie. Het vermogen van tumorcellen binnen te dringen door de extracellulaire matrix (ECM) is een kenmerk van het metastatische fenotype 1-3. Invasion kamers zijn uitgebreid gebruikt als in vitro instrumenten kankercel invasie en migratie bestuderen en kunnen kennis verschaffen over de mechanismen van in vivo tumor invasie en metastase. De kamers bestaan uit cilindrische celkweek inserts genest binnen de putten van celkweek platen. De bodems van de inzetstukken halfdoorlatende polycarbonaat of polystyreen membranen van gedefinieerde poriegrootte.
In de standaard invasie assay worden cellen gezaaid op het inzetstuk membraan met serumvrij medium en geplaatst in celcultuur putjes die zijn gevuld met serum of serum-achtige chemoattractanten te set een chemoattractive kracht. Deze kracht drives cellen om door de semi-permeabele membraan (migratie) of door een coating van extracellulaire matrix (invasie), die vervolgens kunnen worden gekleurd met conventionele kleurstoffen detecteren en kwantificeren van het aantal cellen. Het aantal cellen wordt vervolgens genormaliseerd naar de mate van migratie en invasie in een invasieve cellijn. Met deze methode kan een onderzoeker om de invasieve potentieel van de verschillende celtypen onder verschillende omstandigheden, met inbegrip van genetische manipulaties evalueren.
Hormonen, cytokinen en groeifactoren zijn kritische componenten van serum en worden steeds vaker blijken geassocieerd te zijn met het drijven het invasieve fenotype 4. Echter, de aard, de rol en de specificiteit van deze chemoattractive serum moleculen in het bemiddelen invasie nog steeds ongrijpbaar. De uitdaging blijft om te bepalen welke specifieke factoren in het serum of serum-achtige chemoattractants verantwoordelijk voor het rijden bentkankercel invasie evenals wat moleculen de invasie proces kan remmen. In dit verslag beschrijven we een methode om de mogelijke betrokkenheid van hormonen, cytokinen en / of groeifactoren die in serum evalueren, zoals moleculen drijven de chemoattractie en invasie van kankercellen.
In deze voorgestelde gewijzigde protocol, wordt houtskool strippen gebruikt hormonen, cytokinen en groeifactoren van 2% foetaal runderserum (FBS) verwijderen tot 2% houtskool gestript FBS (CS-FBS) genereren. Beide 2% FBS en 2% CS-FBS worden gebruikt als middelen om de chemoattractive kracht kankercel invasie drijven. Met 2% CS-FBS als chemoattractive middel in vergelijking met normale 2% FBS biedt verscheidene voordelen waaronder eerste en meest prominent, de mogelijkheid om de kankerinvasie fenotype in de gereduceerde / relatieve afwezigheid van hormonen, cytokinen en groeifactoren te bestuderen. Het maakt het ook mogelijk de onderzoeker om te beoordelen of de collectieve verwijdering van hormonen, groeifactoren, en cytokines veroorzaakt een toename of afname van de invasieve index. De assay wordt vervolgens bepaald of de toevoeging van een individuele component, aangeduid als "X" kan remmen, verlagen, verhogen of herstellen de invasieve index op zijn oorspronkelijke waarde (zie figuren 2 en 3). Hoewel deze methode is specifiek voor het bereiken van fysiologische niveaus van de component die wordt verwijderd uit het serum tijdens houtskool strippen, moet worden opgemerkt dat houtskool strippen kunnen worden beïnvloed signaaltransductiewegen. Bijvoorbeeld is gerapporteerd dat houtskool strippen de alkalische fosfatase activiteit van osteoprogenitor cellen kan afnemen en induceren adipogenese door verlaging van MAPK activatoren 5. Houtskool gestript media zijn commercieel verkrijgbaar en zijn gebaseerd op het beschreven protocol dat houtskool gecombineerd met dextran en geïncubeerd met foetaal runderserum O / N 6.
Deze test werd ontwikkeld in RespoNSE een resultaat gerapporteerd door Zucker et al. 7 De auteurs toonden dat een mutant fenotype die gap junction communicatie toonden een verhoging van de invasie index bij het migreren naar media met normale 2% FBS. Deze stijging werd geëlimineerd met de vervanging van houtskool gestript serum. Uit deze resultaten concludeerden de auteurs dat deze mutant beïnvloed migratie naar een lipofiel molecuul (specifieker, een hormoon, groeifactor of cytokine) 7. Het is bekend dat hormonen, groeifactoren en cytokinen signaaltransductiewegen betrokken bij tumorontwikkeling en invasie 4. Het is dus belangrijk dat wetenschappelijke onderzoekers bepalen welke factor (en) drijven de tumor invasie van hun specifieke kankercellen of mutanten onder studie. De test is ontworpen om de rol van individuele componenten richten op de fysiologische concentratie zoals bepaald overeenkomstig het verschil tussen de concentratie van de component &# 8220, X "normale FBS en de CS-FBS. Door de ontwikkeling van deze test, kunnen de onderzoekers meer inzicht in de specifieke invasieve route voor hun systeem te krijgen.
Hormonen, groeifactoren en cytokinen zijn vaak ingedeeld als tumor promotoren 8. Sommige van deze factoren zoals EGF worden gebruikt als directe bron voor chemoattractanten invasie kamers 9. Derhalve lijkt het waarschijnlijk dat deze vormen de belangrijkste onderdelen van het serum die directe tumorinvasie. Dit protocol stelt een eenvoudige, maar significante, wijziging van de gebruikelijke in vitro invasie assay waarmee een onderzoeker om de betrokkenheid van hormonen, groeifactoren en cytokines beoordelen mediëren het invasieve potentieel van kankercellen. Echter, de test om de onderzoeker met een antwoord over de vraag of de procedure effectief voor de studie zullen in een eerste stap in de analyse, zodat geen kostbare tijd en r gebruikenIDDELEN als overbodig beschouwd. Deze methode maakt gebruik van CS-FBS en vertrouwt op de onderzoekers beoordelingsmarge met betrekking tot welke moleculen na te streven als lead kandidaten die mogelijk bemiddelen kankercel invasie. De resultaten van deze analyses blijken bruikbaar te zijn om te bepalen welke serum bestanddelen dienen als chemoattractanten en remmers voor de bepaalde cellijn of mutant bestudeerd. Daarnaast kan deze aanpak helpt de onderzoeker bepalen wat de belangrijkste signaalwegen ofwel bevorderen of remmen kankercel invasie; Zo regisseren toekomst drug design.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumormetastase is een meerstaps proces. De cellen moeten breken door de basaalmembraan, intravasate in ofwel het lymfestelsel of bloed microvaatjes, waarin zij worden getransporteerd naar afgelegen plaatsen. De tumorcellen vervolgens extravasatie en koloniseren een macrometastasis 12. Progressie door de epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT), tumor invasie en metastase is verbeterd door steroïde hormonen 13,14, groeifactoren 15-18 en cytokinen 19-21. Deze moleculen zij…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding sources from D’Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.
Materials
| Item | Vendor | Catalog # | Comments/Description |
| BioCoat Control Inserts with 8.0µm PET Membrane (12 in each of two 24-Well Plates) |
Corning | 354578 | polyethylene teraphthalate (PET) membranes |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, Hmatoxylin/Eosin |
| Fetal bovine Serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
Referenzen
- Weinberg, R. A. . The Biology of Cancer. , (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Dang, Z. C., Lowik, G. M. Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway. Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).
- Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts. J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).
- Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye, ., Bagati, B., Berezney, A., R, A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells. J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).
- Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways. Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).
- Meierjohann, S., et al. MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation. Molecular Cancer. 9, 201 (2010).
- Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).
- Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines. Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the ‘seed and soil’ hypothesis revisited. Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Huang, Y., et al. Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol. Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).
- Huang, Y. H., et al. Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma. Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).
- Scheel, C., Weinberg, R. A. Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links. Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).
- Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc. Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
- Maehara, Y., et al. Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma. J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).
- Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase. Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).
- Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment. J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).
- Rosen, E. M. The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis. EXS. 65, 301-310 (1993).
- Sanz-Moreno, V., et al. ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma. Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).
- Fleming, J. M., et al. Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo. Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).
- Sikora, M.J., V., M.E., M.D., J.M. Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).
