수정<em> 시험관</em> 침공 분석은 호르몬, 중재 암 세포 침략의 사이토 카인 및 / 또는 성장 인자의 잠재적 인 역할을 확인하는
Summary
This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.
Abstract
혈청 암세포 미세 혈관에 자신 intravasation 용이 마이그레이션 침입하는쪽으로 화학 유인로서 기능한다. 그러나, 세포가 이동하는 방향으로 실제 분자는 애매 남아있다. 이 변형 침윤 분석은 세포 이동 및 침입을 구동 대상을 식별하기 위해 개발되었다. 이 기술은 특정 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 또는 암세포의 잠재적 침입을 매개하는 역할을한다 여부를 확인하는 세 조건 하에서 내습 인덱스를 비교한다. 이러한 조건은 ⅰ) 정상 소 태아 혈청 (FBS)이, ⅱ) 숯 막았 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 및 ⅲ) CS-FBS + 분자를 제거 FBS (CS-FBS가), ( "X")를 표시 포함한다. FBS 비교하여 CS-FBS와 세포 침윤에 큰 변화는 변화를 매개 호르몬, 사이토 카인 또는 성장 인자의 관여를 나타낸다. 개별 분자는 다시 자신의 능력을 분석하기 위해 CS-FBS에 다시 추가 될 수있다부르면 또는 침략 표현형을 구출. 또한, 두 개 이상의 요소가 구동 또는 첨가제 또는 침입을 억제하는 다수의 분자의 상승 효과를 평가하기 위해 결합 될 수있다. 전반적으로,이 방법은 호르몬, 사이토 카인, 및 / 또는 성장 인자가 암세포의 특정 형식 또는 특정 돌연변이에 대한 화학 유인 물질 또는 침입의 억제제로서 작용하여 세포의 침윤에서 역할을 수행할지 여부를 결정하는 조사원을 가능하게한다. 특정 화학 유인 물질 및 억제제를 확인함으로써,이 수정 침공 분석은 암 세포 침공을 지시 신호 전달 경로 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
신규 침윤 분석은 특정한 호르몬, 암세포의 침윤 등의 화학 유인 물질 사이토킨 및 / 또는 성장 인자의 참여를 식별하기위한 목적으로 개발되었다. 세포 외 기질 (ECM)를 통해 침투하는 종양 세포의 능력은 전이성 표현형 1-3의 특징이다. 침략 챔버 광범위하게 암 세포 침윤 및 이동을 연구하기 위해 체외 도구로 사용되었고, 생체 내 종양 침윤과 전이의 메커니즘에 관한 지식을 제공 할 수있다. 챔버는 세포 배양 플레이트의 웰 내에 중첩 원통형 세포 배양 용 인서트로 구성된다. 인서트 하의 정의 기공 크기의 반 – 투과성 폴리 카보네이트 나 폴리스티렌 막이다.
표준 침공 분석에서, 세포는 혈청 무료 미디어를 삽입 막에 접종하고 혈청 또는 혈청과 같은 화학 유인 물질로 가득 세포 배양 우물에 배치 s의등 최대 chemoattractive 힘. 이 힘 드라이브의 세포를 검출하고 세포 수를 정량화하는 종래의 염료를 사용하여 염색 할 수있는 세포 외 기질 (침입)의 코팅을 통해 대안 반투막 (마이그레이션)을 통해 이동하거나한다. 세포 수는 다음 비 침습적 세포주의 이동과 침략의 정도에 따라 정규화된다. 이 방법은 연구자가 유전자 조작을 포함한 조건, 다양한에서 다른 세포 유형의 침략 가능성을 평가할 수 있습니다.
호르몬, 사이토 카인 및 성장 인자는 혈청의 중요한 구성 요소이다 점점 침습적 표현형 4 구동과 연관되는 것으로 도시되고있다. 그러나, 여전히 침략을 매개 이러한 chemoattractive 혈청 분자의 성격, 역할, 특이도는 애매 남아있다. 문제는 운전에 대한 책임이 있습니다 혈청 또는 혈청과 같은 화학 유인 물질의 특정 요인이 무엇인지 결정하기 위해 남아분자가 침입 과정을 억제 할 수 어떤 암세포 침윤뿐만 아니라. 이 보고서에서, 우리는 암세포의 침윤 및 chemoattraction 구동 분자로서, 호르몬, 사이토 카인 및 / 또는 혈청에 존재하는 성장 인자의 잠재적 개입을 평가하는 방법을 설명한다.
제안 된 프로토콜의 변형 된 목탄 스트립 핑은 2 % 목탄 스트립 FBS (CS-FBS)을 생성하기 위해 2 % 소 태아 혈청 (FBS)에서 호르몬, 사이토 카인 및 성장 인자를 제거하는 데 사용된다. 2 % FBS와 2 % CS-FBS 모두 암 세포 침공을 구동 chemoattractive 힘을 설정하는 에이전트로 사용됩니다. 통상 2 % FBS와 비교 chemoattractive 제로서 2 % CS-FBS를 사용하여 제 등 여러 가지 이점을 수득하고, 가장 두드러지게, 호르몬, 사이토 카인 및 성장 인자의 감소 / 상대 부재 하에서 암 침윤 표현형을 연구 할 수있는 능력. 또한, 호르몬, 성장 인자 집단 제거 여부를 평가하기 조사자 가능하며, CYtokines은 침략 지수의 증가 또는 감소가 발생합니다. 분석 후, (도 2 및 3 참조) "X"로 표시된 각각의 성분의 첨가는, 감소, 증가를 억제하거나, 원래 값으로 침습적 인덱스를 복원 할 수 있는지 여부를 결정하도록 설계된다. 이 방법론은 목탄 스트립 핑 동안 혈청으로부터 제거 성분의 생리 학적 수준을 달성하기위한 구체적인이지만, 또한 목탄 스트립 핑은 또한 신호 전달 경로에 영향을 미칠 수 있음을 유의해야한다. 예를 들면, 목탄 스트리핑 osteoprogenitor 세포의 알칼리성 포스파타제 활성을 감소 및 MAPK의 활성화 제 (5)의 환원을 통해 지방 형성을 유도 할 수 있다고보고되었다. 숯 박탈 미디어 시판하고 그 프로토콜에 따른 덱스 트란이 숯불을 겸비한 소 태아 혈청 O / N 항온 6 나와있다.
이 분석은 RESPO 개발되었다NSE는 주커 등. (7)에 의해보고 된 결과에 저자는 보통 2 % FBS와 미디어를 향해 마이그레이션 할 때 간극 결합 통신에 영향을 미치는 돌연변이 표현형 침공 지수의 증가를 보여 것을 보여 주었다. 이 증가는 숯불 제거 혈청의 교체와 함께 탈락했다. 이 결과에서, 저자들은 결론 지었다 친 유성 분자 향해 돌연변이의 영향이 이주 (구체적으로, 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 또는) 7. 이곳은 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 및 종양 촉진 및 내습 4에 관련된 신호 전달 경로 매개하는 것으로 알려져있다. 따라서, 과학 연구자가 어떤 요인 (들)이 연구에서 자신의 특정 암 세포 또는 돌연변이 종양 침략을 주도하고 결정하는 것이 중요하다. 성분의 농도 차이에 따라 결정되는 바와 같이 분석은 생리 학적 농도에서의 개별 성분의 역할을 충족하도록 설계 및# 8220; X "정상 FBS와 CS-FBS에서. 이 분석의 개발을 통해, 연구자들은 자신의 시스템에 적용되는 특정 침입 경로에 더 많은 통찰력을 얻을 수 있습니다.
호르몬, 성장 인자, 사이토 카인은 종종 종양 촉진제 (8)으로 분류되어왔다. 이러한 EGF 이러한 요인 중 일부는 침략 챔버 9 화학 유인 물질에 대한 직접 소스로 사용된다. 따라서, 이러한 직접 종양 침윤이 혈청의 주요 구성 요소를 나타내는 것으로 보인다. 이 프로토콜은 조사자가 암세포의 잠재적 침입을 매개 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인의 참여를 평가할 수 종래 내습 시험 관내 분석에 간단하면서도 중요한, 변경을 제안한다. 그러나, 분석은 귀중한 시간 및 R을 사용하지 않도록, 절차는 초기 분석 단계에서 그들의 연구에 효과적인 것인지에 대답 사관을 제공하도록 설계esources 불필요한 것으로 간주합니다. 이 방법은 CS-FBS를 사용하고 잠재적으로 암 세포 침공을 중재 리드 후보로 추구하는 분자있는 상태로 연구자의 판단에 의존한다. 이들 분석의 결과는 혈청 성분이 특정 세포주 또는 돌연변이에 대한 화학 유인 물질 또는 억제제가 연구되고있는 역할을 식별하는 데 유용하다는 것을 증명한다. 또한,이 방법은 조사 홍보 또는 암 세포 침윤을 억제하거나 키 신호 전달 경로를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다; 따라서 미래의 약물 디자인을 연출.
Protocol
Representative Results
Discussion
종양의 전이는 다단계 과정이다. 세포 기저막을 뚫고 그들이 원위부로 이송되는 림프계 또는 혈액 중 미세 혈관 내로 intravasate한다. 종양 세포를 extravasate 및 12에 정착하는 macrometastasis. 중간 엽 전이 (EMT), 종양의 침윤과 전이에 상피를 통해 진행이 스테로이드 호르몬 13, 14로 향상되었습니다, 성장은 15 ~ 18, 사이토 카인 19-21 요인. 이들 분자는 분석의 발전은 종양 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding sources from D’Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.
Materials
| Item | Vendor | Catalog # | Comments/Description |
| BioCoat Control Inserts with 8.0µm PET Membrane (12 in each of two 24-Well Plates) |
Corning | 354578 | polyethylene teraphthalate (PET) membranes |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, Hmatoxylin/Eosin |
| Fetal bovine Serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
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