Électrofilage facteur de croissance libération de microsphères en fibre échafaudages
Summary
This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.
Abstract
This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.
Introduction
Un des défis actuels de l'ingénierie de tissu neural est de créer un conduit de nerf (NC) qui imite la matrice extra-cellulaire, où les nerfs se développent naturellement. La recherche a montré que les cellules répondent à plusieurs facteurs dans leur environnement, y compris mécanique, topographique, adhésif et des signaux chimiques 1-3. L'un des principaux défis dans ce domaine est de déterminer la combinaison appropriée de signaux et la fabrication d'un système qui peut maintenir des repères pour une période prolongée pour soutenir la croissance de la cellule 4. Neurones périphériques sont connus pour préférer un substrat souple, être dirigées par des fibres alignées, et répondent au facteur de croissance des nerfs (NGF) 5-7. CN qui peuvent fournir des indices chimiques pendant des semaines ont été montré pour fournir une meilleure récupération fonctionnelle proche de celle des allogreffes, la norme de référence actuelle pour la réparation nerveuse 8,9.
Matériaux et des méthodes de production différentes peuvent être utilisées pour produire mécanique et topographiqueal Queues de 10-13. Indices mécaniques sont inhérentes à la matière choisie, ce qui rend le choix du matériel approprié pour l'application critique 1,13. Les méthodes de production de contrôler indices topographiques comprennent la séparation de phase, l'auto-assemblage et électrofilature 1,13. Pour les applications à micro, microfluidique, photopatterning, gravure, la lixiviation de sel, ou des mousses de gaz peut également être utilisé 14-17. Électrofilage a émergé comme le moyen le plus populaire pour concevoir des substrats fibreux pour la culture de tissus en raison de sa flexibilité et de la facilité de production 13,18-23. nanofibres de électrofilées sont fabriqués en appliquant une tension élevée à une solution de polymère amenant à se repousser et étirer sur un court intervalle de s'acquitter de 24. Un échafaudage aligné peut être créé par la collecte des fibres sur un mandrin en rotation à la terre et échafaudages non alignés sont collectées sur une plaque fixe 25. signalisation d'adhérence peut être obtenue en revêtant l'échafaudage fibreux esprith fibronectine ou la conjugaison d'un peptide d'adhérence, tels que RGD, de l'HA avant électrofilage 26.
Des signaux chimiques, tels que des facteurs de croissance, sont les plus difficiles à maintenir sur de longues périodes, car ils ont besoin d'une source pour une libération contrôlée. De nombreux systèmes ont été tenté d'ajouter libération contrôlée de réseaux fibreux électrofilées avec différents niveaux de succès. Ces méthodes incluent mélange électrofilature, émulsion électrofilature, coque centrale électrofilature et protéines conjugaison 27. En outre, électrofilature se fait traditionnellement dans un solvant volatil, ce qui peut affecter la viabilité de la protéine 28, donc le maintien de l'activité biologique de la protéine doit être envisagée.
Cette approche traite spécifiquement de combiner les signaux mécaniques, topographiques, chimiques et adhésifs pour créer un échafaudage réglable de croissance des nerfs périphériques. mécanique d'échafaudage est contrôlée avec précision par la synthèseméthacrylé acide hyaluronique (HA). Les sites de méthacrylation sont utilisés pour attacher photo agents de réticulation réactifs. Le matériau réticulé est plus soluble dans l'eau et est exclusivement décomposé par les enzymes 29. La quantité de réticulant modifie la vitesse de dégradation, de la mécanique et d'autres propriétés physiques du matériau. Utilisation de HA à 30% méthacrylation, qui a un module d'environ 500 Pa à la traction, crée un substrat souple qui est proche de la mécanique natifs de tissu neural et est généralement préférée par les neurones 26,29. Électrofilage sur un mandrin rotatif est utilisé pour créer des fibres alignées à un repère topographique. Utilisation électrofilature avec microsphères fournit des signaux chimiques dans l'échafaudage sur des périodes prolongées. Pour soutenir microsphères de croissance des neurites contenant NGF sont utilisés pour créer le signal chimique. Contrairement à la plupart des matériaux électrofilées HA est soluble dans l'eau de sorte que le NGF ne rencontre pas de solvants agressifs pendant la production. Pour ajouter un signal d'adhésif, la scaffold est enduite avec de la fibronectine. Le système complet comprend les quatre types de signaux décrits ci-dessus: alignement des fibres douces (mécaniques) topographiques (NGF) avec libération des microsphères (chimique) revêtue avec de la fibronectine (adhésif). Production et les essais de ce système est décrite dans ce protocole.
Le processus commence par la production de microsphères ayant une double émulsion eau-dans-huile-dans-eau. L'émulsion est stabilisée par un agent tensioactif, l'alcool polyvinylique (PVA). La phase aqueuse interne contient de la protéine. Comme il est ajouté à la phase huileuse, qui contient le matériau de coque PLGA dissous dans du dichlorométhane (DCM), le tensioactif forme une barrière entre les phases de protection de la protéine à partir du DCM. Cette émulsion est dispersée dans l'autre à la phase aqueuse contenant du PVA afin de créer la surface externe des microsphères. L'émulsion stable est agitée pour permettre le DCM à s'évaporer. Après rinçage et lyophilisation vous êtes de gauche avec la suite microsphères secaining la protéine.
Une fois que les microsphères sont remplis, ils sont prêts à être électrofilées dans les échafaudages. D'abord, vous préparez la solution de électrofilature. La viscosité de la solution est crucial pour la formation de fibres approprié. Solutions de HA pure ne répondent pas à cette exigence; PEO est ajouté en tant que polymère de support pour permettre électrofilage. Les microsphères sont ajoutées à la solution résultante et électrofilées dans un échafaudage fibreux avec des microsphères réparties sur l'ensemble.
Une fois que la production est terminée, la protéine doit être testé afin de vérifier sa viabilité. Pour ce faire, une cellule primaire qui répond au NGF peut être utilisé. Ce protocole utilise les ganglions rachidiens (DRG) du 8-10 jours embryons de poulet. Les faisceaux de cellules sont ensemencées sur des échafaudages contenant des microsphères remplies de NGF ou ceux qui sont vides. Si le NGF est encore viable, vous devriez voir une croissance accrue des neurites sur les échafaudages contenant NGF. Si le NGF n'est plus viable, il serapas promouvoir neurites pour étendre et devrait ressembler à la commande.
La procédure exacte décrite ici porte sur l'appui de neurones, cependant, avec des modifications simples à la matière, procédé électrofilage, et des protéines du système peut être optimisée pour différents types cellulaires et tissulaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
De nombreuses études ont montré que les cellules nerveuses peuvent être dirigées par des indices topographiques (alignement de la fibre) et des signaux chimiques (facteurs de croissance) 1,2,10,11,35. Électrofilage est une méthode facile pour créer des fibres alignées. Les facteurs de croissance stimulent la croissance du nerf, mais dans le but de les inclure dans des conduits nerveuses (NC), un procédé de libération prolongée est requise. Pour créer un système plus robuste avec les deux indices…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded through the Richard Barber Foundation and a Thomas Rumble Fellowship (TJW).
Materials
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
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