Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste
Summary
This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.
Abstract
This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.
Introduction
Eine der aktuellen Herausforderungen in neuronalen Gewebe-Engineering ist die Schaffung einer Nervenleitung (NC), die die extrazelluläre Matrix, wobei Nerven wachsen natürlich imitiert. Die Forschung hat gezeigt, dass Zellen reagieren auf verschiedene Faktoren in ihrer Umgebung einschließlich der mechanischen, topographisch, Klebstoff und chemische Signale 1-3. Eine der primären Herausforderungen in diesem Bereich ist die Bestimmung der geeigneten Kombination von Signalen und Herstellung ein System, das Hinweise für einen längeren Zeitraum aufrecht erhalten kann, das Zellwachstum 4 unterstützt. Peripheren Neuronen bekannt sind, um eine weiche Substrat bevorzugen, von ausgerichteten Fasern ausgerichtet werden, und auf den Nervenwachstumsfaktor (NGF) 5-7. NCs, die chemische Signale für Wochen liefern können, sind gezeigt worden, um eine verbesserte funktionelle Erholung näher an der Allografts, der aktuelle Gold-Standard für die Nervenreparatur 8,9 bieten.
Zu produzieren mechanische und topographische können verschiedene Materialien und Produktionsmethoden verwendet werdenal Queues 10-13. Mechanische Signale sind inhärent für das gewählte Material, so dass die Auswahl des geeigneten Materials für die Anwendung kritischen 1,13. Produktionsmethoden zu kontrollieren topographische Hinweise sind Phasentrennung, die Selbstorganisation und das Elektro 1,13. Für Mikroanwendungen, Mikrofluidik, Photostrukturierung, Ätzen, Salz Laugen oder Gas Schäume können auch verwendet werden, 14-17. Elektro hat als beliebteste Weg, um Fasersubstraten für die Gewebekultur-Ingenieur durch seine Flexibilität und Leichtigkeit der Produktion 13,18-23 entstanden. Elektrogesponnene Nano werden durch Anlegen einer Hochspannung zu einer Polymerlösung so dass es zu sich selbst abzuwehren und erstrecken sich über eine kurze Lücke zu entladen 24 hergestellt. Eine ausgerichtete Stützgerüst kann durch Sammeln der Fasern auf einer geerdeten rotierenden Dorn erzeugt werden und blockfreien Gerüsten sind auf einer stationären Platte 25 gesammelt. Haftung Signalisierung kann durch Beschichtung der Fasergerüst wit erreicht werdenh Fibronectin oder Konjugation eines Haft Peptid, wie RGD, zu dem HA, bevor das Elektro 26.
Chemische Signale, wie Wachstumsfaktoren, die am schwierigsten über längere Zeiträume aufrecht zu erhalten, weil sie benötigen eine Quelle für die gesteuerte Freisetzung. Viele Systeme wurden versucht, um eine kontrollierte Freisetzung zu elektro faserigen Netzen mit unterschiedlichem Erfolg hinzuzufügen. Diese Methoden umfassen Mischung Elektro, Emulsion Elektro, Kern-Schale-Elektro und Protein-Konjugation 27. Zusätzlich wird Elektro traditionell in einem flüchtigen Lösungsmittel, das die Lebensfähigkeit des Proteins 28 beeintrachtigt wird daher beibehalten Bioaktivität des Proteins berücksichtigt werden.
Dieser Ansatz befasst sich speziell die Kombination von mechanischen, topographische, chemische und Klebesignale, um eine abstimmbare Gerüst für periphere Nerven Wachstum zu schaffen. Gerüstmechanik genau gesteuert durch Synthetisierenmethacrylierten Hyaluronsäure (HA). Die Methacrylierung Websites verwendet werden, um reaktive Vernetzer Foto anhängen. Das vernetzte Material ist nicht mehr wasserlöslich und wird ausschließlich durch Enzyme 29 gebrochen. Die Menge des Vernetzungs ändert die Abbaurate, Mechanik und anderen physikalischen Eigenschaften des Materials. Verwendung von HA mit 30% Methacrylierung, das einen Zugmodul von ca. 500 Pa hat, erzeugt ein weiches Substrat, das in der Nähe der Mutter Mechanik des Nervengewebe ist, und wird typischerweise durch Neuronen 26,29 bevorzugt. Elektrospinning auf eine rotierende Spindel wird verwendet, um ausgerichteten Fasern für eine topographische Cue erstellen. Mit Elektro zusammen mit Mikrosphären bietet chemische Signale innerhalb des Gerüsts über längere Zeiträume. Um Neuritenwachstum Mikrokügelchen, die NGF verwendet werden, um das chemische Signal erzeugen unterstützen. Anders als die meisten elektro Materialien HA ist in Wasser löslich, so dass die NGF nicht aggressiven Lösungsmitteln bei der Produktion auftreten. Um eine Haft Signal hinzuzufügen, das SCAffold mit Fibronectin beschichtet ist. Das fertige System enthält alle vier oben beschriebenen Arten von Signalen: soft (mechanisch) ausgerichtet (topographische) Fasern mit NGF freiMikroSphären (chemischen) mit Fibronektin (Klebstoff) beschichtet. Herstellung und Prüfung des Systems wird in diesem Protokoll beschrieben.
Das Verfahren beginnt mit der Herstellung der Mikrokugeln mit einer Wasser-in-Öl-in-Wasser-Doppelemulsion. Die Emulsion wird mit einem Tensid, Polyvinylalkohol (PVA) stabilisiert. Die innere Wasserphase enthält das Protein. Wie es zu der Ölphase zugegeben wird, die das in Dichlormethan (DCM) gelöst PLGA Schalenmaterial, erzeugt das Tensid eine Barriere zwischen den Phasen Schutz des Proteins aus der DCM. Diese Emulsion wird als in einem anderen Wasserphase PVA enthält, um die äußere Oberfläche der Mikrokügelchen zu schaffen dispergiert. Die stabile Emulsion wird gerührt, um das DCM verdampft. Nach dem Spülen und Gefriertrocknen Sie mit dem trockenen Mikro Fortsetzung gelassen werdenaining des Proteins.
Nachdem die Mikrosphären abgeschlossen werden, sind sie bereit, in Gerüste versponnen werden. Zuerst wird die Elektro Lösung herzustellen. Die Viskosität der Lösung ist wichtig, um die richtige Faserbildung. Lösungen von reinem HA diese Anforderung nicht zu erfüllen; PEO wird als Trägerpolymer zur Elektro ermöglichen zugegeben. Die Mikrokugeln werden in die Lösung und elektro was eine faserige Gerüst mit Mikrokugeln gleichmäßig verteilt zugegeben.
Sobald die Produktion abgeschlossen ist, sollte das Protein getestet werden, um ihre Lebensfähigkeit zu überprüfen. Um dies zu tun, kann eine Primärzelle, die NGF reagiert werden. Dieses Protokoll verwendet Hinterwurzelganglien (DRG) 8-10 Tage alten Hühnerembryonen. Die Zellbündel werden auf das Gerüst Mikrosphären mit NGF oder diejenigen, die leer sind gefüllt ausgesät. Wenn die NGF noch lebensfähig ist, sollten Sie verbesserte Neuritenwachstum auf den NGF enthält Gerüste sehen. Wenn die NGF ist nicht mehr lebensfähig, es wirdNeuriten zu verlängern nicht fördern und sollte ähnlich der Steuerung angezeigt.
Das hierin beschriebene Verfahren wird genau auf neuronale Stütz konzentriert, jedoch mit einfachen Modifikationen der Material, Elektrospinnverfahren und Proteinen kann das System für unterschiedliche Zell-und Gewebetypen optimiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viele Studien haben gezeigt, dass Nervenzellen durch topographische Cues (Faserausrichtung) und chemische Signale (Wachstumsfaktoren) 1,2,10,11,35 gerichtet werden. Elektro ist ein einfaches Verfahren, um Fasern ausgerichtet erstellen. Wachstumsfaktoren fördern Nervenwachstums aber, um sie in die Nervenleitungen (NC) gehören, wird ein Verfahren zur verzögerten Freisetzung erforderlich. Um ein robustes System mit beiden Signale zu erzeugen, sollten diese beiden Signale kombiniert werden. Mehrere Verfahren w…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded through the Richard Barber Foundation and a Thomas Rumble Fellowship (TJW).
Materials
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
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