Les dosages biochimiques pour l'analyse des activités de l'ATP-dépendant remodelage de la chromatine enzymes

Summary

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Abstract

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Introduction

SNF2 complexes chromatine de la famille de remodelage comprennent une sous-unité ATPase central SNF2 comme ^1,2. Certaines fonctions des ATPases SNF2 comme les enzymes de sous-unités simples, tandis que d'autres fonctionnent comme la sous-unité catalytique de grands complexes multi-sous-unités. Élucider les mécanismes moléculaires par lesquels chacune des sous-unités de complexes de remodelage de la chromatine contribuent à leurs activités nécessite la capacité à effectuer des dosages biochimiques qui dissèquent le processus de remodelage.

ATP-dépendante des nucléosomes remodelage par le complexe INO80 humain et d'autres enzymes de remodelage de la chromatine peut être envisagé comme un processus en plusieurs étapes qui commence par la liaison du remodelage enzyme de nucléosomes, suivie de l'activation de son ADN et / ou des nucléosomes dépendante ATPase, la translocation de l'enzyme sur l'ADN nucléosomique remodelage, et éventuel repositionnement des nucléosomes ^1,2. La compréhension des détails moléculaires de l'ATP-dépendante processus de remodelage de la chromatine récessite dissection de la réaction de remodelage en ses différentes étapes de définition et des contributions des sous-unités individuelles du complexe de remodelage de chromatine à chaque étape de la réaction. Ces analyses nécessitent la capacité d'analyser le remodelage du nucléosome et autres activités utilisant des substrats moléculaires définies in vitro.

Dans un protocole de JOVE précédente, nous avons décrit les procédures utilisées pour générer des complexes et Subcomplexes de remodelage INO80 avec des compositions de sous-unités définies ^3. Ici, nous présentons trois dosages biochimiques qui permettent une analyse quantitative de la liaison, l'ADN et nucléosome activé ATPase, et les activités de remodelage du nucléosome associés à ces complexes nucléosome.

Protocol

1. dépendant de l'ATP nucléosome Rénovation Essais Pour mesurer ATP-dépendant des activités de remodelage des nucléosomes, immunopurifié INO80 ou sous-complexes de INO80 sont incubées avec de l'ATP et un substrat de mononucleosomal, qui contient un seul nucléosome positionné à une extrémité d'un fragment d'ADN de 216 pb, marqué au 32P. Les produits de réaction sont ensuite soumis à une électrophorèse dans des gels de poly-acrylamide natif. <…

Representative Results

Les chiffres montrent des résultats représentatifs de tests biochimiques utilisés pour caractériser les activités de INO80, y compris nucléosome glissière (figure 1) et de liaison (Figure 2) des tests et des analyses d'ADN ou de l'ATPase nucléosome-dépendant (figure 3). L'expérience a montré à la figure 1, on compare la capacité des complexes de INO80 intact purifié à travers FLAG-Ies2 ou FLAG-INO8…

Discussion

Afin de s'assurer que nucléosome remodelage et activités ATPase on observe dans des dosages dépendent de l'activité catalytique des complexes de INO80, et non sur contaminant rénovation et / ou d'enzymes ATPase, nous nucléosome régulièrement dosage remodelage et l'activité ATPase de versions catalytiquement inactives de complexes INO80, purifié dans parallèle avec le type sauvage INO80 utilisant la même procédure. Une réaction témoin négatif dépourvu ATP doit également être effectué l…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	P8340
10x PCR reaction buffer	Roche Applied Science	11435094001
Roche Taq DNA Polymerase	Roche Applied Science	11435094001
NucAway Nuclease-free Spin Columns	Ambion	Cat. # AM10070
ultrapure ATP	USB/Affymetrix	77241 25 UM
bovine serum albumin	Sigma	A9418
N,N,N´,N´-tetramethylethylenediamine (TEMED)	Thermo Scientific	17919	Fisher Scientific
40% Acrylamide/Bis 37.5:1	Amresco	0254-500ML
Sonicated salmon sperm DNAs	GE Healthcare	27-4565-01
10% ammonium persulfate (APS)	Thermo Scientific	17874
benzonase	Novagen	Cat. No. 70664
[α-32P] ATP (3000 Ci/mmol)	PerkinElmer	BLU003H250UC
dCTP, [α-32P]- 6000Ci/mmol	PerkinElmer	BLU013Z250UC
Equipment	Company
PCR thermal cycler PTC 200	MJ Research	PTC 200
Hoefer vertical electrophoresis unit	Hoefer	SE600X-15-1.5
lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes	Costar	3207
Storage Phosphor Screen	Molecular Dynamics	63-0034-79
3MM filter paper	Whatman	28458-005	VWR
Typhoon PhosphorImager	GE Healthcare	8600
ImageQuant software	GE Healthcare	ver2003.02
TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F	Millipore	5725-7
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4	Millipore	IPFL07810
General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe	Biodex	Model 14C