단일 평면 조명 모듈과 와이드 필드 현미경 용 마이크로 모세관 접근법
Summary
단일 평면 조명 현미경 용 모듈 (SPIM)이 쉽게 반전 와이드 필드 현미경에 적합한 3 차원 세포 배양을 위해 최적화되어 설명된다. 샘플은 직사각형 모세관 내에 위치되며, 마이크로 유체 시스템 형광 염료로, 약제 또는 약물은 소량으로 적용 할 수있다.
Abstract
쉽게 반전 와이드 필드 현미경에 적합한 3 차원 세포 배양에 최적화되어 설명 된 광 시트 또는 단일 평면 조명 현미경 (SPIM) 용 모듈 등 다세포 종양 타원체 (MCTS). SPIM 여기 모듈 모양 및 샘플 수직 현미경의 검출 경로 광 시트에 의해 조명되도록 광을 편향시킨다. 시스템은 조명광 시트의 동기 조정뿐만 아니라 형광 검출에 사용되는 대물 렌즈에 의해, 시료 (도 회전시키는 마이크로 모세관 접근 의해 고급 버전에서) 유지하는 직사각형 모세관의 사용을 특징으로한다 형광 염료, 소량의 약제 또는 약물의 응용 프로그램에 대한 마이크로 유체 시스템의 적응에 의해. 이 시스템을 사용하기위한 프로토콜을 제공하고, 몇 가지 기술적 인 세부 사항이보고됩니다. 대표적인 결과는 업 (1)의 측정치를 포함산화제의 첨가시 세포 증식 억제 약물 (독소루비신) 및 분해 생성물과의 부분적인 전환의 유전자 인코딩 글루타티온 센서를 이용하여, (2) 산화 환원 측정을 수행하고, (3) 개시 및 억제시 세포 괴사 라벨링 미토콘드리아 호흡 사슬. 기존 시스템에 비해 본 SPIM 모듈의 차이점 및 이점이 논의된다.
Introduction
잘 확립 방법 (공 초점 또는 다중 광자 레이저 스캐닝 현미경 1-4, 구조화 된 조명 현미경 5,6) 광 시트 또는 단일 평면 조명 현미경 (SPIM) 이외에 3D 촬상 7,8의 방법에 유용한 것으로 입증했다 9. 특히 관심 신약 개발 연구 10,11 위해 점점 사용 3 차원 세포 배양, 예를 들면, 다세포 종양 타원체 (MCTS)에의 응용이다. 또한, SPIM 심지어 장기간 노출 또는 반복적 인 측정에 저조도 투여는이 평면이 광에 노출되는 샘플의 각면의 측정하므로, 시료의 생존을 유지하는 데 필요한 특수한 방법이다. 이것은 각각의 초점면의 검출 샘플 전체가 켜져 다른 현미경 기법과 대조적이며, 광 도즈 합까지 다양한 평면의 기록시되도록 시료 (12)를 손상시킬 수있다. </p>
광 시트 현미경 또는 SPIM는 원통형 렌즈의 사용에 의해 또는 (리뷰 참조 참조. 08) 흥미로운 레이저 빔을 스캔하여 어느 관측 경로에 수직 한 방향으로 샘플의 조명에 기초한다. 이것은 종종 특별한 샘플 챔버 13,14 또는 매트릭스를 필요로 예를 들면, 아가 로스 7,15 특별한 고가 현미경으로 구현. 이러한 시스템에 대한 대안으로서 SPIM위한 비교적 단순한 조명 장치가 개발되고 있으며, 종래의 도립 현미경 (16) (도 1 참조)에 적응. 약 100 μM의 필드의 깊이에 걸쳐 6-10 μm의 두께의 광 시트에이 원통형 렌즈 (0.08 : 50mm, 개구 초점 길이)로 8mm의 직경을 확대하고 초점 레이저 빔 이루어져 . 샘플은 현미경 대물 LEN 앞에 배치 600-900 μm의 내경의 직사각형 모세관에있는형광 검출을위한 발. 이러한 주요 기능은 현재 완성 유지하기위한 형광 검출 (동일한 광로에 사용 (축 방향) 샘플 조명광 시트의 동기 조정하고, 대물 렌즈를 회전시키기위한 진보 된 마이크로 모세관 접근법을 사용함으로써 최적화된다 변위의 길이, 따라서 필요한 양과 비용을 최소화 기계적 피드 보정)하고, 형광 염료, 약제 또는 약물의 응용을위한 마이크로 유체 시스템의 적응을 필요로한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 원고는 광 시트 또는 3 차원 전지 시스템에 최적화 된 단일 평면 조명 현미경 (SPIM) 장치, 예를 들면, 다세포 종양 타원체 (MCTS)를 설명한다. 세 가지 예시적인 애플리케이션은 (1) 세포 증식 억제 약물의 흡수 및 (화학 치료 효능에 기여 여전히 평가 될 남아) 분해물과의 부분적인 전환, 유전자 부호화 글루타티온 센서 사용시에 의한 산화 환원 상태의 (2)의 측정을 포함 산화제를 첨가하고, (…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 토지 바덴 뷔 르템 베르크에 의해뿐만 아니라 유럽 연합 (EU), 유로 파이스 퐁 자금 엘리제 REGIONALE ENTWICKLUNG 다이했다. 저자는 숙련 된 기술 지원 U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 세포주와 클라우디아 Hintze를 제공하기위한 라이너 티그 (ILM 울름를) 감사합니다.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description(optional) |
| microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | for cell spheroid growing |
| agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | for cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | cell line |
| U251-MG-L106 cell line | cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | cell culture supplement |
| penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | antibiotics |
| hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | cell culture supplement |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox – fluorescent cytotoxicity dye |
| rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| capillary | VitroCom | 8260-050 | sample preparation |
| microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | used with driver PDL800-B |
| perestaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
Referenzen
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