Único plano Iluminação Módulo e Abordagem Micro-capilar por um microscópio Wide-campo

Summary

Um módulo para microscopia de iluminação plano único (SPIM) está descrito que é facilmente adaptado a um microscópio de campo amplo invertido e optimizado para culturas de células de 3-dimensionais. A amostra está localizado dentro de um capilar rectangular, e através de um sistema de microfluidos corantes fluorescentes, agentes farmacêuticos ou de drogas pode ser aplicada em pequenas quantidades.

Abstract

Um módulo de folha de luz ou microscopia de iluminação plano único (SPIM) está descrito que é facilmente adaptado a um microscópio de campo amplo invertido e optimizado para culturas de células de 3-dimensional, por exemplo, esferóides multicelulares tumorais (TCM). As formas de módulos SPIM excitação e deflecte a luz de tal modo que a amostra é iluminada por uma folha de luz perpendicular ao percurso de detecção do microscópio. O sistema é caracterizado pela utilização de um capilar para a realização rectangular (e em uma versão avançada também por uma abordagem de micro-capilar para rotação) das amostras, através de ajuste da folha síncrono de luz que ilumina a lente objectiva e usado para a detecção de fluorescência, bem como , por adaptação de um sistema de microfluidos para a aplicação de corantes fluorescentes, agentes farmacêuticos ou drogas em pequenas quantidades. Um protocolo para trabalhar com este sistema é dado, e alguns detalhes técnicos são relatados. Os resultados representativos incluem (1) medição da acimater de uma droga citostática (doxorrubicina) e a sua conversão parcial para um produto de degradação, (2) as medições redox por utilização de um sensor de glutationa geneticamente codificado por adição de um agente oxidante, e (3) a iniciação e rotulagem de necrose celular da inibição da a cadeia respiratória mitocondrial. Diferenças e vantagens da presente módulo SPIM em comparação com os sistemas existentes são discutidos.

Introduction

Além de métodos bem estabelecidos (confocal ou multi-fotão microscopia de varredura a laser ^1-4, estruturado de microscopia de iluminação ^5,6) folha de luz ou de microscopia de iluminação plano único (SPIM) tem provado ser um método valioso de imagens 3D ^{7,8, 9.} De particular interesse é a sua aplicação a culturas de células de 3 dimensões, como por exemplo, esferóides multicelulares tumorais (TCM), que são cada vez mais utilizados para a investigação de descoberta de fármacos ^10,11. Além disso, o SPIM é um método preferencial quando mesmo após a exposição a longo prazo ou medidas repetidas doses de pouca luz são necessárias para manter a viabilidade da amostra, uma vez que para a medição de cada plano da amostra somente este plano será exposto à luz. Isto está em contraste com outras técnicas de microscopia, em que para a detecção de cada plano focal toda a amostra é iluminado, de modo que após a gravação de numerosos aviões as somas de dose de luz e podem danificar-se a amostra ^12. </p>

A microscopia de luz ou SPIM folha baseia-se na iluminação da amostra no sentido perpendicular à linha de observação ou pela utilização de uma lente cilíndrica, ou através da leitura do feixe de laser excitante (para uma revisão ver ref. 8). Isso muitas vezes requer câmaras de amostras especiais ^13,14 ou matrizes, por exemplo, agarose ^7,15, implementado em microscópios especiais de alto custo. Como uma alternativa aos sistemas de um dispositivo de iluminação para comparavelmente simples SPIM foi desenvolvido e adaptado para um microscópio invertido convencional ¹⁶ (ver Figura 1). É constituída por um feixe laser expandido até um diâmetro de 8 mm e focada por uma lente cilíndrica (distância focal: 50 mm, abertura numérica: 0,08) para uma folha de luz de espessura 6-10 uM sobre uma profundidade de campo de cerca de 100 pm . As amostras estão situadas num capilar rectangular de 600-900 um de diâmetro interno colocado em frente do len objectivo microscópios para a detecção de fluorescência. Estas características principais são actualmente preenchido e optimizado pelo uso de avançadas abordagens de micro-capilares para segurar e para fazer rodar as amostras, o ajustamento síncrono da folha de luz iluminante (na direcção axial) e a lente objectiva utilizados para a detecção de fluorescência (caminho óptico idêntico comprimentos de deslocamento exigem uma correcção do arrastamento mecânico), bem como a adaptação de um sistema de microfluídica para aplicação de corantes fluorescentes, agentes farmacêuticos ou drogas, minimizando, assim, as quantidades e as despesas necessárias.

Protocol

1. celular em crescimento esferóide e Incubação Experimento 1: celulares esferóides incubadas com um quimioterápico Prepare de agarose a 1,5% em meio de cultura pela adição de 0,45 g de agarose de 30 ml de meio de cultura (suficiente para 6 placas). Aquece-se a mistura a partir do passo 1.1.1 a, pelo menos, 80 ° C, com agitação de vez em quando. Encher 50 ul da mistura aquecida do passo 1.1.2 em cada poço de uma placa de 96 poços e deixar solidificar dentro de 1-2 hora…

Representative Results

Experimento 1: celulares esferóides incubadas com um quimioterápico Uma varredura z-pilha de uma previamente incubadas células MCF-7 de células esferóide (8 uM de doxorrubicina, 6 horas) está descrito na Figura 3. Ele fornece informações detalhadas sobre a absorção celular e a distribuição de 17 doxorrubicina e do seu produto de degradação 18,19. Dentro da camada celular externa da doxorrubicina fluorescente vermelho esfer…

Discussion

O presente manuscrito descreve uma folha de luz ou microscopia de iluminação plano único (SPIM) dispositivo que é otimizado para sistemas de células em 3 dimensões, por exemplo, tumores esferóides multicelulares (MCTS). Três aplicações exemplares incluem (1) absorção de uma droga citostática e sua conversão parcial para um produto de degradação (cuja contribuição para a eficácia quimioterapêutica ainda a ser avaliada), (2) as medições do estado redox de utilização de um sensor de glutati…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description(optional)
microtiter plate	Orange Scientific	4430100	for cell spheroid growing
agarose	Carl Roth GmbH	3810.1	for cell spheroid growing
MCF-7 cell line	CLS Cell Lines Service GmbH	300273	cell line
U251-MG-L106 cell line			cell line
DMEM	Biochrom AG (Merck Millipore)	FG0435	culture medium
DMEM/Ham's F-12	Biochrom AG (Merck Millipore)	FG4815	culture medium
FCS	Biochrom AG (Merck Millipore)	S0615	cell culture supplement
penicillin/streptomycin	Biochrom AG (Merck Millipore)	A 2213	antibiotics
hygromycin B	PAA Laboratories	P02-015	antibiotic
EBSS	Sigma-Aldrich Inc.	E3024	cell culture supplement
doxorubicin	Sigma-Aldrich Inc.	D1515	fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)
green cytotoxicity dye	Promega GmbH	G8742	CellTox – fluorescent cytotoxicity dye
rotenone	Sigma-Aldrich Inc.	R8875	cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)
hydrogen peroxide (H2O2)	Sigma-Aldrich Inc.	95302	reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)
capillary	VitroCom	8260-050	sample preparation
microscope	Carl Zeiss Jena	Axiovert 200M
AxioCam MRc CCD-camera	Carl Zeiss MicroImaging GmbH	426508-9901-000	CCD-camera
AxioVision data aquisition software	Carl Zeiss MicroImaging GmbH	version 4.8.2.
laser diode	Pico Quant GmbH	LDH-P-C-470	used with driver PDL800-B
perestaltic pump	Ismatec Labortechnik	MS-1 Reglo	re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10
silicone tubes	IDEX Health & Science GmbH	TYGON R3607