Limb remoto Preacondicionamiento Isquémico: una técnica neuroprotector en roedores

Summary

Precondicionamiento isquémico remoto (RIP) es un método de acondicionamiento de tejidos contra el estrés perjudicial. Hemos establecido un método de isquemia a distancia hacia la extremidad posterior, inflando un manguito del esfigmomanómetro durante 5-10 minutos. Las capacidades neuroprotectoras de RIP se han demostrado en un modelo de degeneración de la retina en los roedores.

Abstract

Isquemia subletal protege los tejidos contra la posterior isquemia, más severa a través de la regulación positiva de mecanismos endógenos en el tejido afectado. Isquemia subletal también se ha demostrado que upregulate mecanismos de protección en los tejidos remotos. Un breve período de isquemia (5-10 min) en la extremidad posterior de mamíferos induce respuestas de autoprotección en el cerebro, los pulmones, el corazón y la retina. El efecto es conocido como el precondicionamiento isquémico remoto (RIP). Es una manera terapéuticamente prometedor de proteger órganos vitales, y ya está en ensayos clínicos para lesiones del corazón y el cerebro. Esta publicación muestra un método controlado, mínimamente invasivo de hacer una extremidad – específicamente la extremidad posterior de una rata – isquémica. Un manguito de presión arterial desarrollado para su uso en neonatos humanos está conectada a un esfigmomanómetro manual y utiliza para aplicar presión 160 mmHg alrededor de la parte superior de la extremidad posterior. Una sonda diseñada para detectar la temperatura de la piel se utiliza para verificar la ischemiuna, mediante el registro de la caída de la temperatura de la piel causado por la oclusión inducida por la presión de las arterias de las piernas, y el aumento de temperatura que sigue a la liberación del manguito. Este método de RIP protege a la retina de ratas contra el daño inducido por la luz brillante y la degeneración.

Introduction

La supervivencia de la mayoría, tal vez todos, los tejidos de la cara de estrés metabólico puede ser mejorada por el condicionamiento previo con un período de isquemia subletal ^1,2. El precondicionamiento isquémico (IP) en términos prácticos es la exposición del tejido a la isquemia subletal, antes de las experiencias de tejido factores estresantes más graves, tales como un insulto isquémico posterior. En modelos animales, IP proporciona protección sorprendente con el cerebro, la retina, el corazón y los pulmones ^3-6. En consecuencia, las observaciones en pacientes con accidente cerebrovascular mostraron un vínculo entre los ataques isquémicos transitorios anteriores y mejores resultados clínicos ^7,8. IP también protege los fotorreceptores de la retina de lesiones no isquémicas ^9.

La eficacia de la PI en diversos tejidos y lesiones sugiere que está activando un mecanismo innato de la supervivencia celular presente en todos los tejidos. El precondicionamiento isquémico de miocardio se ha sugerido que tiene efectos protectores a través de la regulación al alzadel factor inducible por hipoxia (HIF), conocido para regular las diferentes vías metabólicas a través de la liberación de adenosina o mediante la apertura de canales de potasio ATP mitocondrial ^10,11. Canales de liberación de adenosina y el ATP de potasio están implicados en la isquemia cerebral, pero, las investigaciones sobre los mecanismos neuroprotectores de condicionamiento isquémico hasta la fecha se han centrado en las modificaciones de anti-excitotoxicidad, vías anti-apoptóticos y anti-inflamatorios ^12,13. En general, la comprensión del proceso molecular de acondicionamiento isquémico para la protección de las neuronas es limitado.

Intentos precondicionamiento isquémico remoto para acondicionar distantes órganos críticamente importantes (corazón, cerebro, pulmón) por generar isquemia en los tejidos menos críticas. Precondicionamiento isquémico remoto (RIP) usando la extremidad posterior ha demostrado ser neuroprotector en modelos de roedores de accidente cerebrovascular ^14-17. El método descrito por nosotros proporciona un prot simple, fiable y no invasivoocol para inducir RIP.

La gran mayoría de protocolos RIP implica la extremidad posterior, presumiblemente debido a la arteria femoral situada en la extremidad posterior superior se puede identificar fácilmente y se accede para la sujeción quirúrgica y la aplicación del torniquete. En las extremidades isquémicas invasiva estudios para el estudio de cerebro y protección de la piel, la isquemia se indujo mediante la separación de la arteria femoral de la ingle y los ligamentos pinzamiento de la arteria femoral ^2,15,18.

La isquemia resultante de cualquiera extremidad manguitos de sujeción o femoral de la arteria ha sido confirmado por los cambios en la extremidad incluyendo una pérdida de pulso, disminución en la oxigenación y una caída en la temperatura de la piel. Isquemia a distancia puede ser confirmado por la pérdida de pulso utilizando Doppler láser o ultrasonido Doppler ^17-19. Temperatura de la piel se puede utilizar como alternativa a Doppler aunque la relación no es lineal ^20,21. Grabaciones precisas de temperatura son comunes en los laboratorios y lataser fácilmente incorporados en los estudios isquémicas remotas.

Una alternativa a la cirugía de fijación femoral es la inducción de isquemia usando un torniquete. Aplicación del torniquete produce isquemia comparable al conseguido con sujeción buque; Kutchner et al. comparación de la arteria femoral invasiva de sujeción para un torniquete no invasivo y encontraron ambos métodos detuvieron el flujo sanguíneo a la extremidad y daño de la piel reducido en un modelo de cirugía plástica de la isquemia colgajo de piel ^18. Manguitos ya sea la pierna o el brazo y el aumento de la presión del manguito a encima de la presión arterial sistólica se ha encontrado para ser protector contra el daño isquémico en cerdos y seres humanos ^17,19,22.

Different torniquete se acerca a inducir remoto incluye isquémica el uso de un manguito de presión arterial o un ^17,22,23 banda elástica. Sin embargo, el uso de una banda elástica para inducir isquemia es un método inseguro, potencialmente dando lugar a una cantidad no regulada de presión en elextremidad, con aumentos de presión por encima de 500 mmHg siendo grabado en los seres humanos ^24. Además, isquemia de las extremidades usando una banda elástica conduce a daño muscular en ratas después de la eliminación de la banda ^23, según la evaluación de colorante azul de Evans, un marcador in vivo de la permeabilidad de miofibras ^25. En contraste, la entrega de una presión controlada para el torniquete se puede lograr utilizando un manguito de presión arterial conectado a un ^17,19,22,26 esfigmomanómetro.

En este estudio, se utilizó un modelo de lesión de luz de degeneración de los fotorreceptores para demostrar la eficacia neuroprotectora de precondicionamiento isquémico remoto. Isquemia a distancia se indujo inmediatamente antes de la lesión luz, evitando la posterior degeneración de los fotorreceptores según lo confirmado por las pruebas de la función retiniana. El video que acompaña demostrará la aplicación de isquemia a distancia no invasiva.

Protocol

Declaración de Ética: El protocolo sigue las directrices de cuidado de animales de la Universidad de Sydney, AEC # 5657. La anestesia fue aprobado por el comité de ética animal (Universidad de Sydney, AEC # 5657). 1. Preparación del equipo Utilice el seguimiento de la temperatura de la piel en tiempo real. Encienda el ordenador, y el hardware de adquisición de datos. Software de registro de la temperatura Abrir y ajustar el ajuste de temperatura de entre 30 a 35 °…

Representative Results

Un manguito de presión arterial elevada por encima de 160 mmHg detiene el flujo sanguíneo a la extremidad posterior como se ve claramente en la figura 1B. La falta de oxigenación de los tejidos resultó en una reducción de la temperatura del pie del animal para un protocolo de isquemia-reperfusión (Figura 2). La temperatura del pie (33 ° C) fue menor que la temperatura central y la reducción de forma fiable durante la elevación de presión del manguito (31 ° C) aumentando cuand…

Discussion

Roedor extremidad posterior isquemia se indujo con éxito con un esfigmomanómetro manual de la entrega de la neuroprotección y el manguito de los fotorreceptores de la retina. Un hallazgo consistente con isquemia inducida acondicionado protección de los fotorreceptores de una lesión ligera ^9,28.

En esencia, la isquemia a distancia hace que la privación breve de oxígeno a los tejidos. Por lo tanto, el precondicionamiento isquémico remoto tiene muchas similitudes con acondici…

Materials

Gold series DuraShock Hand Aneroid Sphygmomanometer	Welch Allyn	DS56	Manual Sphygmomanometer
Neonate [size 2] 1 Tube, 10 Pack	Welch Allyn	5082-102-1	Limb blood pressure cuff
Luer lock adaptor	Welch Allyn	5082-178	Adaptor for neonatal cuff
Thermistor pod	AD Instruments	ML 309	skin tempertature unit
Skin temperture probe	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044	Skin temperature recorder
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Towel			optional: awake remote ischemia
Isoflo – 100% Isoflurane -250 ml	Abbot Animal Health	05260-05	optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia
Ketamil – ketamine 100 mg/ml – 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		optional: injectable anaesthetic remote ischemia
Xylium – Xylazine 100 mg/ml – 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		optional: injectable anaesthetic remote ischemia