تقييم الزرد وظائف الكلى باستخدام التخليص الفحص الفلورسنت
Summary
الزرد هو أداة شعبية لنموذج مرض الكلى المزمن (CKD). ومع ذلك، حجمها صغير يجعل من المستحيل لتقييم وظائف الكلى باستخدام الطرق التقليدية. نحن تصف الفلورسنت الكلى صبغ إزالة الفحص 1 التي تسمح التحليل الكمي وظائف الكلى الزرد في CKD.
Abstract
يقدم الجنين الزرد نموذج لين العريكة لدراسة توالد ونموذج مرض وراثي البشري. وعلى الرغم من بساطتها النسبية، والكلى الزرد يتطور وظائف في تقريبا بنفس طريقة البشر. وهناك فرق كبير في بناء الكلى البشرية هو وجود الملايين من النيفرون مقارنة الزرد التي لديها اثنين فقط. ومع ذلك، وتبسيط مثل هذا النظام المعقد إلى وحدات وظيفية أساسية ساعدت فهمنا لكيفية تطور الكلى ويعمل. في الزرد، خط الوسط تقع الكبيبة هو المسؤول عن ترشيح الدم الأولي إلى قسمين الأنابيب سليفة الكلوة أن تتباعد لتشغيل ثنائيا أسفل محور الجنينية قبل التفجير لبعضها البعض في مجرور. يتم ملؤها الأنابيب سليفة الكلوة بشدة من أهداب متحركة تسهل حركة الترشيح على طول أنبوب صغير مجزأة، والسماح للتبادل مختلف المواد المذابة قبل أن تخرج في النهاية عن طريق مجرور 2-4. العديد من الجينات المسؤولة عن CKD، المؤتمر الوطني العراقيluding تلك المتعلقة تكون الأهداب، وقد درس في الزرد 5. ومع ذلك، تجذب أعدادا كبيرة وقد ظهر صعوبة في تقييم وظائف الكلى الزرد بعد التلاعب الجيني. المقايسات التقليدية لقياس خلل في الكلى في أثبتت البشر غير متعدية إلى الزرد، ويرجع ذلك أساسا إلى بيئتها المائية وحجم صغير. على سبيل المثال، فإنه من غير الممكن جسديا لاستخراج الدم من الجنينية نظمت الأسماك لتحليل اليوريا والكرياتينين المحتوى، كما أنها صغيرة للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، الزرد لا تنتج ما يكفي من البول لاختبار على بروتينية بسيطة "مقياس"، والتي غالبا ما يتم تنفيذ أثناء الفحوص الأولية المريض. نحن تصف فحص الفلورسنت التي تستخدم الشفافية البصرية من الزرد لمراقبة كميا إزالة صبغة الفلورسنت، مع مرور الوقت، من الأوعية الدموية والخروج من خلال الكلى، لإعطاء قراءة من وظيفة الكلى 1،6-9.
Introduction
الكلى البشري يلعب دورا حاسما في تصفية النفايات الأيضية من الدم واستعادة المواد المذابة اللازمة للحفاظ على التوازن الخلوي. وهناك عدد من الأمراض الوراثية البشرية التي تسبب خلل في الكلى. المرض الكلوي ورثت الأكثر شيوعا هو مرض وراثي جسمي الكلى المتعدد الكيسات (ADPKD) التي تتميز تطوير السوائل تملأ الأكياس داخل الأنابيب الكلوية. الأضرار الناجمة عن تكون الكيسة يضر ظائف الكلى 10. ADPKD لديه قوع 1: 800-1: 1،000 والحسابات لمدة 8 – 10٪ من مرضى الفشل الكلوي في المرحلة النهائية (ESRF) 11. قد تورطت عدة جينات أن تسبب ADPKD بما في ذلك polycystin-1 (PKD1) و-2 (PKD2)، وهو ما يمثل حوالي 85٪ و 15٪ من الحالات على التوالي 12،13. وعلاوة على ذلك، والمنتجات الجين لPKD1 و-2 توطين إلى هدب وأساسية لتكون الأهداب 14،15. هناك الآن عائلة المعترف بها من الاضطرابات الجينية البشرية، والمعروفة باسموciliopathies، والتي تؤثر على وظيفة الأهداب ويؤدي في CKD 16.
عدد متزايد من الأمراض الوراثية البشرية التي تؤثر على التنمية الهدبية وظيفة يستحوذ على اهتمام العالمية في هذا عضية أثرية مرة واحدة في الاعتبار. وهدب، نتوء الخلوي يشبه الشعر، وأثرى مع مستقبلات والقنوات الأيونية اللازمة لتنبيغ أحداث خلية يشير الرئيسية. يتكون هدب من الخيط المحوري القائم على أنيبيب، منظم عادة إلى تسع الحلل أنيبيب ترتيب شعاعيا مع أو بدون زوج المركزي من الأنابيب الدقيقة القميص. يحدد هيكل axonemal نوع وطريقة العمل الهدبي. الترتيب أنيبيب 9 + 2 يضفي حركية إلى هدب حيث يتم استغلاله في حركة السوائل عبر الأسطح الظهارية. التكوين 9 + 0 هو غير متحركة ولكن يعتقد أن وظيفة بشكل رئيسي في أحداث الإشارات الخلوية 17. وبصرف النظر عن CKD، عواقب ضعف الهدبية هي مجموعة من الخصائصميزات ciliopathy التي تشمل، والسمنة، وتنكس الشبكية، كثرة الأصابع، وضعف الادراك 16. ومع ذلك، CKD هو من بين الأكثر تضر نوعية حياة المريض، وبالتالي قوة دافعة رئيسية وراء تطوير الاقتضاء في النماذج الحية لالهدبية المتعلقة CKD.
الزرد هو نموذج ممتاز لفهم مسببات مرض وراثي البشري. تطور سريع، وإنتاج عدد كبير من البيض والأنسجة شفافة، ونمو الرحم السابقين يسمح العمليات التنموية الزرد إلى أن تصور والأحداث البيولوجية التلاعب مع سهولة كبيرة. الجينات يمكن تعديلها وراثيا باستخدام النجاح الذي تحقق مؤخرا من أدوات التحرير الجينوم (كريسبر 18 و TALENS 19)، طرقت أسفل باستخدام العقاقير تكنولوجيا morpholino 20، أو ينظم دواء عن طريق إضافة مركبات لبيئتها المائية. في الواقع، الزرد توفر منصة للقيام البريدxperiments التي ليست متساهلة في النماذج الحيوانية الأخرى. في حين الزرد هي الفقاريات بسيطة نسبيا (مقارنة مع البشر) أنها تشترك في العديد من أجهزة الحفظ وظيفيا، والجينات، والعمليات يشير مشتركة مع البشر. على سبيل المثال، الكلى الزرد يشبه بشكل ملحوظ في البنية والوظيفة مقارنة مع 21،22 البشر. ولكن، خلافا الكلى الثدييات التي تطور من خلال سلسلة من المراحل، وتميز كل من الكلى أكثر تطورا (سليفة الكلوة، mesonephros، والكلوة التالية)، والزرد الجنينية يتطور إلا سليفة الكلوة، الشكل الأكثر غير ناضجة من الكلى. بينما الملايين من النيفرون يمكن العثور على تشكيل اللبنات في الكلى الثدييات، الجنين الزرد تمتلك اثنين فقط. وتنصهر الكبيبات، والتي تسمح للرشاحة الدم الأولي، في خط الوسط فقط بطني إلى الشريان الأورطي. مرشحات الدم خلال الكبيبات في الأنابيب سليفة الكلوة التي تعمل نحو caudally على طول المحور، التفجير قبل الخروج عبر مجرور. وتو سليفة الكلوةومهدبة bules بشكل كبير مع أهداب متحركة التي تبيحه لتدفق الترشيح نحو الخروج الذيلية 3،4. يحافظ هذا الهيكل سليفة الكلوة بسيط التوازن الزرد من خلال عدة أسابيع من نمو اليرقات حيث تطوير في نهاية المطاف إلى mesonephros بنية أكثر تعقيدا 21. ومع ذلك، فإن الزرد أبدا يطور الكلوة التالية 21. وعلى الرغم من الخصوصيات الزرد، ومجزأة وكليون الزرد مع ملامح التعبير الجيني مساوية لتلك التي لوحظت في الثدييات، وبالتالي يوفر منقطع النظير في نموذج الجسم الحي لتكون الكلية 3،22.
عادة يتم اختبار المرضى لوظائف الكلى من خلال سلسلة من اختبارات الدم والبول. وعادة ما يتم تحليل الدم لمدة الأملاح الذائبة واليوريا والكرياتينين. مستويات عالية من اليوريا والكرياتينين وتركيز الملح غير طبيعية تدل على مشاكل في وظائف الكلى. تحليل البول باستخدام مقياس اللونية بالكشف عن مستويات غير طبيعية من البروتين، blooد، والقيح، والبكتيريا والحاضر السكر في عينات البول. هذه الاختبارات تتطلب عادة حوالي 30 مل من البول أو من 5 – 10 مل من الدم. فقد كان من الصعب ترجمة هذه الأنواع من المقايسات للمشاريع الصغيرة في الكائنات نموذج الجسم الحي، مثل الزرد، ويرجع ذلك أساسا إلى طبيعة مستحيلة لجمع الدم أو البول الكافي لإنجاز الفحص. هنا، نحن معالجة نقص الزرد اختبارات وظائف الكلى المناسبة ووصف تقنية مبتكرة لدراستها. عن طريق حقن صبغة الفلورسنت في مجرى الدم ونحن قادرون على رصد وتحديد فردي مع مرور الوقت الترشيح وإفراز النشاط الفلورسنت من الدم عن طريق الكلى. هذه الطريقة يمكن استخدامها لدراسة تلف الكلى الناجمة عن المرض، ونحن نوفر مثال.
Protocol
Representative Results
Discussion
الزرد تقدم أداة قيمة لنموذج مرض وراثي البشري، فإن استخدامها كأداة العلمي لفي الجسم الحي الأبحاث مكنت الدراسات التفصيلية للانهيار الجيني للكثير من النظم البيولوجية، بما فيها الكلى. ومن المفهوم كثيرا الآن عن كيفية تطور الكلى الزرد ووظائفها. أوجه الشبه اللافتة ل?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المساعدة التقنية التي تقدمها Jaipreet Bharj. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الاتحاد الأوروبي FP7 (SYSCILIA -241955) والكلى الهولندي مؤسسة (CP11.18).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
Referenzen
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease – clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, a. j. t., Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. . The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
