형광 정리 분석을 사용하여 Zebrafish의 신장 기능의 평가
Summary
제브라 피쉬는 만성 신장 질환 (CKD)을 모델로 인기있는 도구입니다. 그러나, 작은 크기 것이 불가능 전통적인 방법을 이용하여 신장 기능을 평가한다. 우리는 CKD에 제브라 피쉬의 신장 기능의 정량 분석을 할 수있는 형광 염료 신장 클리어런스 분석 한 설명합니다.
Abstract
제브라 피쉬 배아 형성기를 공부하고 인간의 유전 질환을 모델로 다루기 쉬운 모델을 제공합니다. 그 단순함에도 불구하고, 제브라 피쉬의 신장 개발 및 인간과 거의 같은 방식으로 작동합니다. 인간 신장의 구성에 큰 차이를 갖는 두 지브라 피쉬 비교 네프론 수백만의 존재이다. 그러나, 기본 기능 단위로 같은 복잡한 시스템을 단순화하면 신장이 개발하고 운영하는 방법에 대한 우리의 이해를 도왔습니다. 제브라 피쉬에서 사구체에있는 중간 선은 배설강에서 서로 융합하기 전에 배아 축 아래로 양측 실행 분기 두 pronephric 세관에 초기 혈액 여과를 담당합니다. pronephric 세관은 크게 마지막으로 배설강 2-4로 종료하기 전에 다양한 용질의 교환을 허용, 분할 가느 다란 관을 따라 여과 액의 이동을 용이하게 운동성 섬모에 의해 채워집니다. CKD, INC에 대한 책임을 많은 유전자ciliogenesis에 관련된 사람들을 luding, 제브라 피쉬 (5)에서 연구되고있다. 그러나, 주요 연신 다시 유전자 조작 후에 지브라 피쉬 신장 기능 평가에있어서의 어려움이 있었다. 인간은 주로 자신의 수중 환경과 작은 크기로, 제브라 피쉬의 비 번역을 입증 한 전통적인 분석은 신장 기능 장애를 측정합니다. 예를 들어, 배아 및 우레아 크레아티닌 함량의 분석을 위해 준비된으로부터 물고기가 너무 작을 경우, 혈액을 추출하기 위해 물리적으로 불가능하다. 또한, 제브라 피쉬는 종종 초기 환자 시험 중에 수행되는 간단한 단백뇨 '봉'에서 테스트에 대한 충분한 소변을 생산하지 않습니다. 우리는 신기능 1,6-9에서 판독을주고, 혈관계로부터 밖으로 신장을 통해 정량적으로 시간이 지남에 따라 형광 염료의 간극을 모니터링 지브라 피쉬의 광학적 투명성을 이용하여 형광 분석법을 설명한다.
Introduction
인간의 신장은 혈액에서 신진 대사 폐기물을 필터링 및 세포의 항상성을 유지하는 데 필요한 용질을 복구하는 데 중요한 역할을한다. 신장 기능 장애를 일으킬 인간 유전 질환들이있다. 가장 흔한 유전 신장 질환은 신장의 세뇨관 내에 채워진 유체 주머니의 발달을 특징으로 염색체 우성 다낭성 신장 질환 (ADPKD)이고; cystogenesis에 의한 피해는 신장 기능 (10)에 해로운 것입니다. 800-1 : ADPKD 1의 발생을 갖고 1000 8 차지하고 – 말기 신부전 (ESRF) 11 명 중 10 %. 여러 유전자는 약 85 % 각각 12, 13의 경우 15 %를 차지, polycystin-1 (PKD1) -2 (PKD2)를 포함 ADPKD 원인이 연루되어있다. 또한, 유전자 PKD1을위한 제품과 -2는 섬모에 지역화 및 ciliogenesis (14, 15)의 기초입니다. 로 알려진 인간의 유전 질환의 인식 가족은 지금이섬모 기능에 영향을 CKD (16)이 발생할 ciliopathies.
섬모 개발 및 기능에 영향을 미치는 인간의 유전 질환의 증가는 한번 고려 흔적 세포 기관의 글로벌 관심을 끌고있다. 섬모, 머리와 같은 세포 돌기, 수용체 및 주요 세포 신호 이벤트의 전달에 필요한 이온 채널 풍부하다. 섬모는 일반적으로 또는 단일 항 미세 소관의 중심 쌍없이 구 방사형으로 배열 된 미세 소관는 이중으로 구성 미세 소관 기반 axoneme로 구성되어 있습니다. axonemal 구조 섬모 작용의 유형 및 모드를 정의한다. 9 + 2 미세 소관 배열이 상피 표면에서 유체의 이동에 사용된다 섬모에 운동성을 부여한다. 9 + 0 구성이 아닌 운동성이 있지만 세포 신호 이벤트 (17)에 주로 기능에 생각된다. 그렇다 CKD에서, 섬모 기능 장애의 결과는 특성의 집합, 비만, 망막 변성, 다지증을 비롯한 다양한 기형 및인지 장애 (16)를 포함 ciliopathy 기능. 그러나, CKD는 환자의 삶의 질에 가장 해로운 따라서 섬모 관련 CKD에 대한 생체 내 모델에서 적절한 개발 뒤에 주요 원동력 사이입니다.
제브라 피쉬는 인간의 유전 질환의 원인을 이해하는 훌륭한 모델입니다. 이들의 빠른 개발, 계란의 많은 수의, 투명한 조직 및 전 자궁 내 성장의 생산은 제브라 피쉬의 발달 과정을 시각화 및 생물학적 이벤트가 상당한 쉽게 조작 할 수 있습니다. 유전자는 유전자, 게놈 편집 도구 (CRISPR 18 TALENS 19)의 최근 성공을 사용하여 변경 안티센스 모르 폴리 노 기술 (20)를 사용하여 무너 뜨렸다, 또는 약리학 자신의 수생 환경 화합물의 첨가에 의해 조절 될 수있다. 실제로, 제브라 피쉬 전자를 수행 할 수있는 플랫폼을 제공다른 동물 모델에서 허용되지 않습니다 xperiments. 제브라 피쉬 동안 그들이 인간과 공통으로 많은 기능 보존 기관, 유전자 및 신호 프로세스를 공유 (인간에 비해) 비교적 간단한 척추 동물이다. 예컨대, 제브라 피쉬 (21, 22)의 신장은 인간에 비해 구조와 기능에 상당히 유사하다. 그러나 단계의 연속을 통해 개발 포유류의 신장과 달리, 각각의 선진 신장 (pronephros, mesonephros 및 metanephros)로 표시, 배아 제브라 피쉬는 pronephros, 신장의 가장 미숙 한 형태를 개발하고 있습니다. 네프론의 수백만 포유류 신장의 빌딩 블록을 형성 찾을 수 있습니다 동안, 제브라 피쉬 배아는 두 가지를 가지고있다. 초기 혈액 여과 액을 허용 사구체는, 대동맥에 중간 선 단지 복부에 융합되어있다. 하수구로 배출하기 전에 융합 축을 따라 꼬리 쪽 실행 pronephric 세관에 사구체를 통해 혈액 필터. pronephric 부엉bules 심하게 꼬리 출구 3,4으로 여과 액의 흐름을 허용하는 경우에는 운동성 섬모와 섬모가있다. 이 간단한 pronephric 구조는 결국 더 복잡한 mesonephros 구조 (21)로 발전 애벌레 성장의 몇 주를 통해 제브라 피쉬의 항상성을 유지한다. 그러나, 제브라 피쉬는 metanephros (21)을 개발하지 않았다. 제브라 피쉬의 특이성에도 불구하고, 제브라 피쉬의 네프론은 포유 동물에서 관찰 된 것과 동일한 유전자 발현 프로파일로 분할되고, 따라서 nephrogenesis 3,22에 대한 생체 내 모델에서 타의 추종을 불허을 제공합니다.
정기적으로 환자는 혈액과 소변 일련의 테스트를 통해 신장 기능 검사를하고 있습니다. 일반적으로 혈액 용해 염, 우레아 및 크레아티닌에 대해 분석된다. 우레아, 크레아티닌 및 비정상적인 염농도가 높은 수준의 신장 기능에 문제를 나타낸다. 비색 딥 스틱을 사용하여 소변 검사는 단백질, (B100)를의 이상을 검출D, 고름, 박테리아 및 소변 샘플에서 설탕 선물. 혈액 10 ml의 – 이러한 테스트는 일반적으로 소변의 약 30 ml의 5 필요합니다. 그것은 주로 분석을 수행 할 충분한 혈액 또는 소변 수집 불가능 특성상 이러한 제브라 생체 내 모델 유기체, 작은 검정에 이러한 유형의 번역하기 어려웠다. 여기서는 적절한 지브라 피쉬 신장 기능 검사의 부족을 해결하기 위해 연구 및 혁신적인 기술을 설명한다. 혈류 내로 형광 염료를 주입함으로써, 우리는 신장을 통하여 혈액 여과 및 형광 활성의 배설을 개별적으로 모니터링하고 시간이 지남에 따라 수치화 할 수있다. 이 방법은 우리의 예를 제공하는 질환으로 인한 신장 손상을 연구하는데 이용 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish의 인간의 유전 질환을 모델링하는 유용한 도구를 제공하고, 생체 내 연구를위한 과학적인 도구로서 자신의 사용은 신장을 포함한 많은 생물학적 시스템의 유전자 분석의 상세한 연구를 활성화. 대부분은 지금 제브라 피쉬 신장 개발 및 기능을하는 방법에 대해 알 수있다. 인간의 nephrogenesis과 질병의 원인 유전자 (21)와 동성에 눈에 띄는 유사점 이해하는 기초가 얼마나 제브…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jaipreet Bharj에서 제공하는 기술 지원. 이 작품은 EU-FP7 (SYSCILIA -241955)와 네덜란드의 신장 재단 (CP11.18)에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
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