走査型電子顕微鏡による肝類洞内皮細胞およびそれらの開窓の分析のための標準化された方法
Summary
The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.
Abstract
Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.
Introduction
肝類洞内皮細胞（のLSEC）は、高度の肝正弦波の壁を覆う内皮細胞を分化されます。のLSECを非diaphragmedある穿孔で穿孔され、経細胞は、直径50〜250 nmの細孔。のLSECの表面の最大20％が篩板1-3（ 図1）と呼ばれる数十〜数百のグループに通常は穿孔によって覆われています。開窓は非常に効率的限外濾過システムを作成し、血液と肝細胞との間にプラズマとnanosubstratesの転送を可能にします。開窓は動的構造である – それらのサイズおよび/または数の両方は、種々の生理学的状態、薬物、および疾患に応じて変更することができます。例えば、開窓は摂食状態4よりも絶食が大きいです。 2ジヨードアンフェタミンは開窓の数を増加させ、5,6および細胞あたり穿孔のサイズおよび数の減少は、加齢および多くの疾患状態7-13で起こります</sup>。穿孔のサイズと数の正確な測定は、LSECの形態は、種々の疾患、毒性、および生理学的状態に影響される方法を理解するために重要です。肝機能に及ぼす影響。および開発するための治療的介入1を開窓を調節。
開窓の研究は困難です。開窓の直径は、両方の無傷の肝臓組織または培養のLSECに電子顕微鏡を用いて、先にのみ観察が可能であった、従来の光学顕微鏡の解像度の下にあります。走査型電子顕微鏡（SEM）は、最も頻繁に、SEMは、数千の内皮表面と測定の大部分の観察を可能にするために開窓サイズ、周波数及び気孔率（開窓によって穿孔さLSEC膜の割合）を研究するために使用されていますそうでない場合は数十開窓の何千もの。その有用性にもかかわらず、結果がために、SEMベースの研究から報告されますこのような開窓大きさ、数、周波数および多孔性などのLSECのパラメータは、文献（ 表1）に大きく異なります。
開窓とふるい板は、契約、ブレーク拡張または試料調製中に合体壊れやすい構造であり、このように慎重な処理は、それらの整合性を維持するために必要とされます。上昇灌流圧14;固定液およびバッファ15の誤った浸透圧;不十分な固定または固定時間。とポストの固定、脱水、乾燥の速度は超微細構造の保存（ 図2）と干渉アーティファクトを生成することができるSEMのための処理のすべての領域です。開窓の損失（「窓外放出 '）と開窓収縮が減少し開窓径および細胞間隙率で、その結果、貧困層の固定の結果として発生する可能性があります。 SEM分析のための試料の保存性を向上させる方法は、先に15-17に記載されていると説明されますここでは、試料の保存性を改善する方法についての追加のヒントを。試料保存の主な目標は、LSECの表面を可視化することができるように、正弦波から血液を除去し、高圧または遅延固定のいずれかからLSECの損傷を回避するためです。門脈を介して固定液の全肝灌流は、肝臓固定するための好ましい方法です。詳細に説明したように他の場所で16,18灌流が低圧で行われなければならない（例えば、H 2 0 10 cm）のLSECに圧力関連灌流遺物や損傷を回避するためには、典型的には、細胞膜における内などの大きなギャップを明らかに。他の箇所19で詳細に説明したようしかし、合理的な固定は、多くの場合、ヒトおよび動物の肝生検の針灌流を使用して得ることができます。血液試料からフラッシュされるまで、この技術は、直接組織に固定液を注入することを含むと組織がしっかりと固定されています。電子顕微鏡用試料の固定はPERFする必要があります肝臓極めて迅速自己分解プロセスの結果として生じる微細構造の変化を防止するための血流の停止後、できるだけ速やかにormed。
我々は、アーチファクトの混入を最小限に抑え、かつ開窓の測定を標準化する画像解析の方法をも提供します。多孔性および開窓周波数について顕微鏡写真用正弦波の選択の変化、アーティファクトの画像解析、およびセル面積の測定は、公表された結果の主な相違につながっています。開窓とデータ表示のための最小要件の評価および測定のための標準化されたアプローチは、明らかに以前4,10,20-31文献で 扱われていません。
Protocol
Representative Results
Discussion
正確かつ再現肝類洞内皮の状態を測定する能力は、これらの非常に特殊化した細胞の生物学を理解する上で重要なステップです。このような構造化照明顕微鏡32などの新しい技術、原子間力顕微鏡33とD-STORM（直接確率光学Reconstrucion顕微鏡）34は、 インビトロでこれらの細胞の形態に関する重要な情報を付与しますが、SEMはにその構造を視覚化し、測定す?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue Number | Comments |
| EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
| Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
| Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
| Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
| Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
| Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
| Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
| Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
| Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
| Ketamine | Must be optained under licence | ||
| Xylazine | Must be obtained under licence | ||
| Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |
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