Стандартизованный метод для анализа печени Синусоидальная эндотелиальных клеток и их фенестраций по сканирующей электронной микроскопии
Summary
The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.
Abstract
Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.
Introduction
Печень синусоидальные эндотелиальные клетки (LSECs) весьма дифференцированные эндотелиальные клетки, которые выстилают стенки печеночной синусоиды. LSECs перфорируют с фенестраций, которые недиафрагмированном, трансцеллюлярного поры 50-250 нм в диаметре. До 20% поверхности LSECs покрыта фенестраций, которые, как правило, в группах от десятков до сотен называемых сито пластины 1-3 (Рисунок 1). Фенестраций разрешить передачу плазмы и nanosubstrates между кровью и гепатоцитами, создания эффективной системы ультрафильтрации. Фенестраций являются динамические структуры – как их размер и / или номер может быть изменен в ответ на различные физиологических состояниях, наркотиков и болезней. Например, Фенестрации больше в голодном, чем в сытом состоянии 4; 2-ди-iodoamphetamine увеличивает количество оконных 5,6 и уменьшение размера и количества фенестраций за клеток происходит в процессе старения, и многие болезненных состояний 7-13 </sup>. Точное измерение размера и количества фенестраций важно для понимания того, как LSEC морфология влияют различные болезни, токсический и физиологических состояний; их влияние на функции печени; а также для разработки фенестрацию-модуляции терапевтических вмешательств 1.
Изучение фенестраций трудно. Диаметр фенестраций лежит ниже разрешением обычного светового микроскопа, так ранее только наблюдение с помощью электронного микроскопа и в интактных тканей печени или культивированного LSECs удалось. Сканирующий электронный микроскоп (SEM), была наиболее часто используется для изучения размеров оконных, частоту и пористость (процент от LSEC мембраны, перфорированный фенестраций), потому что СЭМ позволяет для наблюдения больших участков поверхности эндотелия и измерения тысяч, если не десятки тысяч фенестраций. Несмотря на полезность, результаты, которые сообщили из SEM на основе исследований дляLSEC параметры, такие как размер оконной, количества, частоты и пористости широко варьировать в литературе (таблица 1).
Фенестраций и сита пластины являются хрупкими структуры, что контракт, разорвать, расширяют или сливаются в ходе подготовки образца, таким образом, осторожны обработка необходима, чтобы сохранить их целостность. Повышенное давление перфузии 14; неверно осмолярность фиксатора и буферов 15; недостаточно фиксация или фиксация времени; и скорость после фиксации обезвоживания и сушки все области обработки для SEM, которые могут вызывать артефакты, которые мешают сохранению ультраструктуры (рис 2). Потеря фенестраций ('дефенестрация') и оконных усадки может возникнуть в результате плохой фиксации, в результате уменьшенного диаметра оконных и пористостью. Методы повышения сохранности образцов для анализа СЭМ были описаны ранее 15-17 и будет обсуждатьсяздесь с дополнительные советы о том, как улучшить сохранение образца. Основными задачами являются сохранение образца, чтобы удалить кровь из синусоид, так что поверхность LSEC могут быть визуализированы и избежать повреждения от LSEC либо высоким давлением или задержки фиксации. Всего перфузии печени фиксатора через воротную вену является предпочтительным методом для фиксации печени. Как описано подробно в другом месте 16,18 перфузии должны быть предприняты при низком давлении (например, 10 см H 2 0), чтобы избежать давления, связанных перфузии артефакты и повреждение LSEC, обычно проявляется в виде больших зазоров в пределах клеточной мембраны. Тем не менее, разумно фиксации часто могут быть получены с помощью иглы перфузию биопсии печени от человека и животных, как описано подробно в другом месте 19. Этот метод включает в себя непосредственно инъекционных фиксатором в ткани, пока кровь не смывается образца и ткани является твердой и фиксированной. Фиксация образцов для электронной микроскопии должна быть перфорацияormed как можно быстрее после прекращения кровотока для предотвращения ультраструктурным изменения, происходящие в результате печени крайне быстрые процессы автолитических.
Мы также представляем метод анализа изображений, что сводит к минимуму включение артефактов, и стандартизирует измерение фенестраций. Изменение в выборе синусоиды для микрофотографии, анализ изображений артефактов и измерение площади ячейки для пористости и оконных частоты привели к существенному расхождений в опубликованных результатах. Стандартизированный подход для оценки и измерения фенестраций и минимальных требований для представления данных не были четко рассмотрены в литературе ранее 4,10,20-31.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способность точно и воспроизводимо измерять состояние печени синусоидальной эндотелия является важным шагом в понимании биологии этих узкоспециализированных клеток. Новые методы, такие как структурированной подсветки микроскопии 32, атомно-силовой микроскопии 33 и Д-STORM (?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue Number | Comments |
| EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
| Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
| Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
| Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
| Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
| Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
| Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
| Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
| Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
| Ketamine | Must be optained under licence | ||
| Xylazine | Must be obtained under licence | ||
| Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |
Referenzen
- Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., Arias, I. M. . The Liver: Biology and Pathobiology. , 387-404 (2009).
- Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
- Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).
- Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).
- Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).
- Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).
- Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).
- Le Couteur, D. G., Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. . Calorie Restriction, Aging and Longevity. , 191-216 (2010).
- McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).
- Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).
- Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).
- Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).
- Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).
- Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).
- Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).
- Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).
- Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).
- Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).
- Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. , (2014).
- May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6 (7), e21478 (2011).
- Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).
- Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).
- Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).
- Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).
- Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).
- Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).
- Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).
- Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).
- Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).
- Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).
- Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).
