のサイレンシング<em> BRCA2</em>ヒト培養細胞における新規BRCA2-調節される生物学的機能を同定するために、
Summary
Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.
Abstract
従来の生化学的分析による腫瘍抑制タンパク質BRCA2とその検出のサイレンシングは、ヒトのBRCA2タンパク質（約390キロダルトン）のサイズが大きいために大きな技術的課題を表します。我々は、ヒト上皮細胞株において、それぞれ、ヒトのBRCA2を沈黙し、内因性BRCA2タンパク質を検出するための標準的なsiRNAトランスフェクションおよびイムノブロッティングのプロトコルの変更を報告しています。重要なステップは、トランスフェクション試薬の比が高いsiRNAを、同じ実験内のsiRNAトランスフェクションの2その後のラウンドがあります。抗BRCA2抗体を用いたイムノブロット分析によって判断されるように、我々は一貫して人間のBRCA2遺伝子の70％以上のサイレンシングを達成するための標準プロトコルへのこれらおよびその他の変更を使用しました。また、代わりに、従来の70〜100°Cおよび免疫ブロット法の他の技術的な最適化の55℃での細胞溶解物の変性は、無傷のBRCA2タンパク質の検出が可能であってもWH出発物質が非常に少量エン入手可能であるか、またはBRCA2タンパク質の発現レベルが非常に低い場合。ヒト細胞におけるBRCA2の効率的なサイレンシングは、腫瘍中の病原性BRCA2変異によって影響を受ける可能性がある新たな分子経路および細胞機能を調べるために、腫瘍細胞を含む、無傷のBRCA2と細胞内でBRCA2の機能を破壊するための貴重な戦略を提供しています。効率的なサイレンシングおよびBRCA2のような他の「大規模な」タンパク質の分析のためにこのプロトコルの適応が容易に達成する必要があります。
Introduction
BRCA2（乳癌感受性遺伝子-2）遺伝子は、リコンビナーゼ酵素のRad51 1の機能を調節することにより、DNA二本鎖切断の修復に重要な役割を演じる腫瘍抑制タンパク質をコードします。 BRCA2はまた、転写の調節および細胞周期の制御2に関係しています。 BRCA2遺伝子に生殖細胞変異は、男性に女性と前立腺癌における乳癌および卵巣癌に常染色体優性の感受性を誘導するだけでなく、他の癌タイプ3,4の素因。しかし、抑制またはDNA損傷5-7を引き起こす化学療法剤に対する癌細胞の脆弱レンダリングしてもよいBRCA2の機能を低下させる癌、BRCA2変異を開発するリスクの増加にもかかわらず。 BRCA2タンパク質レベルの低下は、そのBRCA2タンパク質を示唆し、いくつかの癌の種類で検出されているものの、散発性の癌はBRCA2変異 （<3％）の低速度を示します非突然変異依存機構7,8を介して散発性の癌において腫瘍形成の間に失われることがあります。したがって、完全に癌生物学の文脈において、ならびに他の生物学的環境においてBRCA2の機能を理解することが重要です。
哺乳動物細胞における遺伝子の新規な機能を識別するために使用される強力なツールは、その発現を抑制することです。一例として、正常上皮細胞の様々なBRCA2の発現を抑制することは、最近アノイキス耐性の調節、癌細胞浸潤性および転移能9の取得中に重要なステップとして、BRCA2の新規機能の同定につながりました。遺伝子サイレンシングは、細胞小干渉（SI）RNAまたは特定の遺伝子を標的とする短いヘアピン（SH）RNA分子のいずれかで導入することによって達成することができます。高いsiRNAの効力とその使いやすさは重要な生物学的プロセスに新たな洞察を得ることを目的とした実験をサイレンシングするため、それを優先ツールを作ります新たな治療標的を同定するためにND。しかし、遺伝子発現の効率的なノックダウンは、すべての遺伝子のために容易に達成できないことがあり、細胞の種類に応じて非常に変化してもよいです。細胞内タンパク質のレベルの減少は、調査中の最も関連性の表現型であるため、遺伝子産物の解析をイムノブロッティングにより遺伝子サイレンシングを定量化することが重要です。これに関しては、BRCA2タンパク質は、さらに課題を提示：大きなタンパク質（約390キロダルトン）をされ、技術的な困難が免疫ブロット法を含む、従来の生化学的解析のために存在します。
ここでは、ヒト上皮細胞株におけるBRCA2の効率的なサイレンシングのためと分析をイムノブロッティングによりノックダウンBRCA2タンパク質の迅速かつ成功した検出のために最適化されたプロトコルを報告しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
女性と男性の乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、及びメラノーマ3,4を含むいくつかの癌型のリスク増加にBRCA2遺伝子リードの生殖細胞変異は、多くの研究は、生物学的機能を理解するために行われているのでBRCA2タンパク質の。これらの研究のほとんどが原因BRCA2のような巨大なタンパク質の分析における技術的困難に遺伝ベースの主です。 BRCA2タンパク質の発現をサイレンシ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project “FaReBio di Qualità”.
Materials
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Non-targeting Pool |
| Lipofectamine RNAiMAX Reagent | Life Technologies | 13778075 | Transfection Reagent |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medium for transfection procedure |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast | Life Technologies | EA0378 | Gel for protein electrophoresis |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Life Technologies | NP0007 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Sample Reducing agent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagent for protein electrophoresis |
| HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Prestained marker for gel electrophoresis |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipment for protein electrophoresis/transfer |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagent for Western blotting |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Reagent for Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagent for Western blotting |
| BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 dilution |
| Beta-tubulin monoclonal antibody | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1000 dilution |
| Skim Milk powder | Sigma Aldrich | 70166 | Reagent for Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagent for Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Chemiluminescence system |
| PNT1A cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 95012614 | PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40 |
| Nthy cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells |
| Cell Proliferation Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit for cell proliferation assays |
Referenzen
- Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
- Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).
- Martin, A. M., et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic. J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).
- Castro, E., Eeles, R. The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer. Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).
- Vencken, P. M., et al. Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients. Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434, 917-921 (2005).
- Arbini, A. A., et al. Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2. Oncogenesis. 2, e82 (2013).
- Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma. Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).
- Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death. Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).
- Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives. Pharm Res. 14, 853-859 (1997).
- Su, L. K., et al. Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression. Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. ‘. ‘Western blotting’: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Hunter, F. W., et al. Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. , (2014).
- Drew, Y., et al. Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2. J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434, 913-917 (2005).
- Ihnen, M., et al. Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).
- Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction. Mol Cells. , (2015).
