의 침묵<em> BRCA2</em> 배양 된 인간 세포에 소설 BRCA2 규제 생물학적 기능을 확인하는
Summary
Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.
Abstract
종양 억제 단백질 BRCA2와 기존의 생화학 적 분석에 의해 그 검출 침묵은 인간의 BRCA2 단백질 (약 390 kDa의)의 큰 크기 때문에 큰 기술적 도전을 나타냅니다. 우리는 인간의 상피 세포 라인에 각각 내생 BRCA2 단백질을, 인간의 BRCA2를 침묵과 감지 표준 siRNA를 형질 감염 및 면역 프로토콜의 수정 사항을보고한다. 주요 단계는 형질 전환 시약 비율이 높은 siRNA와 같은 실험 내에서 siRNA를 형질의 두 후속 라운드를 포함한다. 안티 BRCA2 항체와 분석을 면역 블 판단으로 우리가 지속적으로 인간 BRCA2 유전자의 70 % 이상 침묵을 달성 표준 프로토콜이 다른 수정을 사용. 또한, 대신에, 종래의 70 ~ 100 °의 C 및 면역 과정의 다른 기술적 최적화 55 ° C에서의 세포 용 해물의 변성은 그대로 BRCA2 단백질의 검출도 가능 WH출발 물질은 매우 낮은 양의 도중에 가능 또는 BRCA2 단백질 발현 수준이 매우 낮은 경우. 인간의 세포에서 BRCA2의 효율적인 침묵은 종양 세포를 포함 그대로 BRCA2와 세포에서 BRCA2 기능을 방해 할 수있는 새로운 분자 경로 및 종양에서 병원성 BRCA2 돌연변이에 의해 영향을받을 수 세포 기능을 조사하기 위해 가치있는 전략을 제공합니다. 효율적인 침묵과 BRCA2와 같은 다른 '큰'단백질의 분석을 위해이 프로토콜의 적응은 쉽게 달성 할 수 있어야합니다.
Introduction
BRCA2 (유방암 감수성 유전자-2)의 유전자 재조합 효소 RAD51 (1)의 기능을 조절하여 DNA 이중 가닥 나누기를 복구하는 데 중요한 역할을하는 종양 억제 단백질을 암호화한다. BRCA2는 또한 전사의 조절 및 세포주기 조절에 관련이있다. BRCA2 유전자의 생식 세포 돌연변이는 다른 암 유형 3,4에 상 염색체 우성 남성의 유방과 여성에서 난소 암과 전립선 암에 대한 감수성뿐만 아니라 경향을 유도한다. 그러나, 억제 나 DNA 손상의 원인 5-7 화학 치료제로 암세포 더욱 취약 할 수있다 BRCA2 렌더링 기능을 줄이고 암, BRCA2 돌연변이 현상의 위험 증가에도 불구. 산발적 암은 BRCA2 단백질을 제안, BRCA2 단백질의 감소 수준은 일부 암 종류에서 발견 된하지만 BRCA2 돌연변이 (<3 %)의 낮은 비율을 나타내비 돌연변이에 의존하는 메커니즘 7,8 통해 산발적 암에서 종양 발생시 손실 될 수 있습니다. 따라서, 완전히 암 생물학의 맥락에서뿐만 아니라 다른 생물학적 설정에서 BRCA2 기능을 이해하는 것이 중요하다.
포유류 세포에서 유전자의 신규 한 기능을 식별하는 강력한 도구는 그 발현을 침묵하는 것이다. 일례로서, 정상 상피 세포의 다양한 사일런 BRCA2 발현은 최근 anoikis 저항성 암세포 침습 및 전이 능력 (9)의 획득 동안 중요한 단계의 레귤레이터 등 BRCA2의 신규 기능의 확인하게되었다. 유전자 침묵은 작은 셀 간섭 (SI) RNA 또는 특정 유전자를 대상으로 짧은 헤어핀 (SH) RNA 분자 중 하나에 도입함으로써 달성 할 수있다. 고의 siRNA의 효능과 사용의 용이성이 중요한 생물학적 과정에 새로운 통찰력을 확보하기위한 실험을 입을 것이에게 특혜 도구를 만들ND 새로운 치료 목표를 식별합니다. 그러나, 유전자 발현을 효율적으로 녹다운 모든 유전자를 쉽게 달성되지 않을 수 있고, 세포의 종류에 따라 매우 가변적 일 수있다. 세포 내 단백질 수준에서의 감소는 조사중인 가장 관련된 표현형이기 때문에, 유전자 생성물의 분석에 의해 면역 블 유전자 침묵을 정량화하는 것이 중요하다. 이와 관련하여, BRCA2 단백질은 더 도전을 제공합니다 : 큰 단백질 (약 390 kDa의를)되고, 기술적 인 문제가 면역을 포함하여 기존의 생화학 적 분석을 위해 존재한다.
우리는 여기서 인간 상피 세포 라인에 BRCA2의 효율적인 침묵과 분석을 면역 블에 의해 넉다운 BRCA2 단백질의 신속하고 성공적으로 감지에 최적화 된 프로토콜을보고합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
암수 유방암, 난소 암, 전립선 암, 췌장암 및 흑색 종 3,4- 포함한 여러 암 종류의 위험 증가 BRCA2 유전자 납 생식계 돌연변이는, 다수의 연구는 생물학적 기능을 이해하고 수행 되었기 때문에 BRCA2 단백질의. 이러한 연구의 대부분은 인해 BRCA2 같은 거대한 단백질을 분석하는 기술적 인 문제에 유전 적 기반 주로. BRCA2 단백질 발현을 침묵하고 분석하기위한 여기에 설명 된 방법은 생물?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project “FaReBio di Qualità”.
Materials
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Non-targeting Pool |
| Lipofectamine RNAiMAX Reagent | Life Technologies | 13778075 | Transfection Reagent |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medium for transfection procedure |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast | Life Technologies | EA0378 | Gel for protein electrophoresis |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Life Technologies | NP0007 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Sample Reducing agent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagent for protein electrophoresis |
| HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Prestained marker for gel electrophoresis |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipment for protein electrophoresis/transfer |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagent for Western blotting |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Reagent for Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagent for Western blotting |
| BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 dilution |
| Beta-tubulin monoclonal antibody | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1000 dilution |
| Skim Milk powder | Sigma Aldrich | 70166 | Reagent for Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagent for Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Chemiluminescence system |
| PNT1A cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 95012614 | PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40 |
| Nthy cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells |
| Cell Proliferation Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit for cell proliferation assays |
Referenzen
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