Summary

분자 프로브 최적화 (광합성 생물의 세포 사망을 확인하는 방법<em> Microcystis aeruginosa의</em>) 유동 세포 계측법을 사용하여

Published: January 29, 2016
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Summary

미생물 인구는 전체 동작을 지시 할 수있는 실질적인 세포 이질성가 포함되어 있습니다. 유동 세포 계측법을 통해 분자 프로브 분석 그러나 그것의 응용 프로그램이 종 사이에서 변화, 세포의 생리 학적 상태를 확인할 수 있습니다. 이 연구는 과소 평가하거나 거짓 긍정적 인 결과를 기록하지 않고, 정확하게 cyanobacterium 인구 내에서 세포 사망을 결정하는 프로토콜을 제공합니다.

Abstract

필드와 실험실 연구에서 미생물 개체군은 형태 학적 및 생리 학적 파라미터에 높은 이질성을 표시하는 것으로 나타났다. 미생물 세포 분열 및 대사 활동이 감소함으로써 휴면 상태로 존재할 수있는 균체의 실시간 상태를 결정하면, 라이브 또는 죽은 카테고리로 넘어 간다. 전체 인구의 생존을 결정하는 데 도움이 할 수있는 신속하고 정확한 방법은 분자 프로브 감지 및 미생물의 정량화에 대한 필요성, 세포 계측법 (FCM)을 흐름을 제공 감안할. 막 완전성을 검출하도록 모델에 남조류 Microcystis 녹농균을 SYTOX 그린 SYTOX 오렌지를 사용함으로써, 우리는 단일 세포 사망의 신속한 표시에 대한 방법을 개발 양도. actio의 필적 모드가 유사 여기 및 발광 파장이 다른 제품이 있지만,이 저널에서 사용 분자 프로브 (각각으로 녹색 또는 오렌지색 핵산 프로브 부른다앞이 프로브를 언급에 N, 우리는 구체적으로)를 참조하십시오. 분자 프로브를 사용하여 프로토콜 농도와 배양 시간에 주로 서로 다른 종 사이에 다릅니다. M.aeruginosa에 출발이 프로토콜에 따라 녹색 핵산 프로브는 30 배양 분, 10 분 후 1 μM에서 오렌지 핵산 프로브 후 0.5 μM의 농도에서 최적화되었습니다. 막 손상 세포의보고에서 주도 언급 최적의보다 적은 양의 프로브 농도. 반대로, 두 프로브 5 μM 농도 이상은 '생방송'세포 '는 비 생존 "세포 수의 위에 표현 선도, 대상 형광을 생성함으로써 비특이적 염색의 유형을 나타낸다. 제어 세대의 적합성이 논의 될 수 남아 있지만, 양성 대조군 (열 사망)는, 검증 가능한 죽은 바이오 매스를 제​​공했다. 녹색과 주황색 핵산 프로브 우리 드를 최적화하기위한 단계의 논리적 순서를 보여줌으로써시아 노 박테리아 효과적으로 생리 상태를 분석하는데 사용될 수있다 프로토콜을 만드는 방법 monstrate.

Introduction

세포는 지속적으로 생체 변수를 수정하고 그 기능을 변화시켜 환경에 반응 복잡한 시스템이다. 3 동종 미생물 인구 자연과 실험실 모두의 인구 역학은 비교적 일정한 환경 조건 (1)에서 발생, 개체군의 발전에 의해 영향을받습니다. 자연 미생물 군집의 변화로 인해 환경 조건의 매우 가변적 특성으로 발생한다. 이 때로는 확률 과정​​ 이후 인구 평균에 매우 다른 소집단을 생산하고 있습니다. 최근의 증거는 이러한 생리적 개체군은 환경 조건에 다르게 반응과 크게 영향을 전체 인구의 3,4에 영향을 미치는 신호 화합물 또는 억제제를 생성 할 수 있음을 밝혔다.

집단 내 이질성을 정의하는 방법을 설정하면 해제의 열쇠입니다다양한 환경에서 미생물의 생태를 derstanding 및 heterocysts 같은 전문화 된 세포를 개발하고, 이러한 환경 변동에 대한 응답으로 형태 학적 이질성을 표시 크게 영향 인간의 물 보안에. 종 등 Anabaena와 같은 독성 Microcystis으로, 귀찮은 시아 노 박테리아의 지식을 구축 할 때 필수적이다 및 akinetes 2. 대조적으로, Microcystis 세포 스트레스 반응 중에 명백한 형태 이질성을 표시하지 않는다. 실용적인 비 생존 세포 간의 차별 생리 분화의 가장 중요한 측면이다 미생물 개체군에 대한 이해를 허용한다. 그러나 세균의 생존 자체의 개념 문제는 어렵고 가난 1,5,6을 특징으로 남아있다.

유동 세포 계측법 (FCM)은 각각의 세포를 분석하는 안정적이고 빠른 방법입니다. 단일 셀의 물리 치료사에 대한 이해를 높이려면FCM의 뜻을 통해, 프로브 분자는 생화학 적 대사 과정 (7)의 개수를 구별하는데 사용되어왔다. 이 세포 및 인구 수준에서 종의 증가 지식을 주도 차례로 수자원 관리 8,9 도움이되었습니다. 그러나, 생물 인해 분자 프로브 설계 및 프로토콜 구현 6,10,11의 숫자로 이끈 세포 벽과 세포막에 구멍 펌프, 분자 프로브 흡수 및 유출의 관점에서 차이가있다. 상업 및 연구 목적을 위해 사용 가능한 분자 프로브는 종종 매우 상이한 세포 유형에 적용될 수있는 일반적인 프로토콜에 공급된다. 하나는 다른 6 하나의 세포 유형을 위해 개발 된 프로토콜을 전송하기에 매우주의해야하며, 효과적으로 사용하기 전에 분자 프로브를 최적화하기 위해 필수적인 작업은 따라서이다.

녹색과 주황색 핵산 프로브는 최소한의 기본 더블 및 단일 가닥 핵산을 모두 결합 선택의 ivity 및 세포의 세포막의 무결성을 평가하기 위해 사용된다. 녹색 핵산 프로브는 세포 생존의 지표로서 작용할 수 요오드화 프로피 듐 등의 계 화합물 (12)과 같은 다른 분자 프로브에 비해 현저하게 개선 된 셀 라벨 형광 신호를 갖는다. 용어 "세포 생존 '는 여기 DNA 분해가 세포막 무결성 손실 후에 발생한다고 가정. 핵산 프로브는 세 양전하와 비대칭 시아닌 염료이며, 모두 진핵 11,13 및 원핵 생물 14, 15에, 특징 농도에서 양막 세포를 입력 할 수 없습니다. 핵산 핵산 프로브의 결합은 멤브레인 무결성이 손상된 세포에서 내인성 신호로부터 형광 방출> 500 배 증가까지 초래할 수있다. 이러한 녹색 핵산 프로브 분자 프로브는 단일 세포 생리학의 좋은 지표가 될 수 있지만, 필요에 t 존재혼자 Microcystis 실험에서 0.5 μm의 15 – 0.1 μM에서 30 분 및 농도 범위 – 19 배양 시간은 7 분에서 다양대로 O, 의도 된 대상 유기체 각 프로브를 최적화 할 수 있습니다.

여기에서 우리는 녹색의 세포 측정 분석과 (날짜에 시아 노 박테리아 종 M.aeruginosa에서 테스트되지) 비교적 새로운 오렌지 핵산 프로브를 최적화하는 프로토콜을 제시한다. 다음 개발 된 방법론은 다른 종에 전송함으로써 미생물의 이해와 생태적 행동을 증가 다른 분자 프로브의 프로토콜을 최적화하기위한 플랫폼으로 사용될 수있다.

Protocol

분자 프로브 및 흐름 사이토 1. 준비 초순수 여과하고 H 2 O에 필요한 농도의 분취 액에 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 5 mM의 용액으로 공급 된 핵산 프로브의 원액을 희석 25 O C까지 사용 – -5 O C와 사이의 어두운 조건에서 핵산 프로브를 저장합니다. 사이토 흐름과 부하 소프트웨어 패키지를 켭니다 (FCM 사양 재료 / 장비의 표 참조). 시료 주입 프?…

Representative Results

지수 상에 M.aeruginosa 배치 문화에서 앞으로 빛 산란 (FSC)와 측면 빛 산란 (SSC) 출력은 각각 셀 크기 (직경) 및 내부 단위에 대한 정보 (그림 1A)를 제공합니다. FSC는 M.aeruginosa하기에는 너무 큰 및 / 또는 작은 세포를 구별 할 수있다. 이 차별 또는 게이팅은 FSC 출력 (도 1C)의 소정 포인트 사이의 데이터에 의해 정제 할 수있다. 빨간색 광원?…

Discussion

15,19,22,23 분자 프로브를 사용하여 출판물의 증가 숫자는 믿을 수 있고 정보 데이터는 5,6,8를 얻을 수 있음을 나타냅니다. 아직 같은 농도 및 배양 시간 6,10 모든 종에 걸쳐 효과적 일 수있다 세포 생존에 대한 완벽한 얼룩은 없습니다. 변경된 형광 방출과 프로브의 같은 종류가 정확한 농도와 항온 처리 시간 (표 1 및 3)을 확립 할 필요를 나타낸다. 이 ?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 연구 및 시설에 대한 지원 및 자금 지원을 위해 박사 과정 학생 데이브 하트 넬과 본머스 대학을 인정하고 싶습니다.

Materials

Cyanobacteria Media Sigma-Aldrich C3061-500ML BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid BD Biosciences 653155 Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min.  Followed by 2mins of sheath H2O.
Flow Cytometer BD Biosciences N/A (by request) BD Accuri C6
SYTOX Green Life Technologies S7020 Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO
SYTOX Orange Life Technologies S11368 Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO

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Diesen Artikel zitieren
Chapman, I. J., Esteban, G. F., Franklin, D. J. Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (107), e53036, doi:10.3791/53036 (2016).

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