Molecular Probe Optimization para determinar mortalidade celular em um fotossintético organismo (<em> Microcystis aeruginosa</em>) Utilizando citometria de fluxo

Summary

Populações microbianas contêm heterogeneidade celular substancial, que pode ditar o comportamento geral. Análise sonda molecular através de citometria de fluxo pode determinar estados fisiológicos de células, no entanto a sua aplicação varia entre as espécies. Este estudo fornece um protocolo para determinar com precisão a mortalidade de células dentro de uma população cianobactéria, sem subestimar ou gravar resultados falsos positivos.

Abstract

Subpopulações microbianas em estudos de campo e de laboratório foram mostrados para exibir elevada heterogeneidade em parâmetros morfológicos e fisiológicos. A determinação do estado de uma célula microbiana tempo real ultrapassa categorias vivas ou mortas, tal como micróbios podem existir num estado dormente, pelo qual a divisão celular e actividades metabólicas são reduzidos. Dada a necessidade de detecção e quantificação de micróbios, a citometria de fluxo (FCM) com sondas moleculares proporciona um método rápido e preciso para ajudar a determinar a viabilidade da população em geral. Usando SYTOX Verde e Laranja SYTOX no modelo de cianobactérias Microcystis aeruginosa para detectar a integridade da membrana, desenvolvemos um método transferível para indicação rápida de mortalidade única célula. As sondas moleculares utilizados nesta revista serão referidas sondas de ácidos nucleicos como verdes ou laranja, respectivamente (embora existam outros produtos com comprimentos de onda de excitação e emissão semelhantes que têm uma modos comparáveis ​​de action, que se referem especificamente à tona mencionado sondas). Protocolos que utilizam sondas moleculares variam entre espécies, diferindo principalmente na concentração e de incubação vezes. Seguindo este protocolo descrito em M.aeruginosa a sonda de ácido nucleico verde foi optimizada em concentrações de 0,5 uM, após 30 min de incubação e a sonda de ácido nucleico de laranja a 1 uM, após 10 min. Em ambas as concentrações sondas menos do que o ideal afirmou levou a uma subnotificação de células com danos na membrana. Por outro lado, as concentrações de 5 | iM e mais elevada em ambas as sondas exibiu um tipo de coloração não específica, por meio de que as células "ao vivo" produziu uma fluorescência alvo, levando a uma representação através do número de células não viáveis ​​''. Os controlos positivos (mortos pelo calor), desde biomassa morta testável, embora a adequação da geração controlo mantém-se sujeita a debate. Ao demonstrar uma seqüência lógica de etapas para otimizar as sondas de ácidos nucleicos verde e laranja de nós,monstrate como criar um protocolo que pode ser utilizado para analisar o estado fisiológico de cianobactérias eficaz.

Introduction

A célula é um sistema complexo, que responde constantemente para o meio ambiente, modificando parâmetros fisiológicos e alterar a sua função. A dinâmica populacional das populações microbianas isog�nicas tanto na natureza eo laboratório são afectados pelo desenvolvimento de subpopulações, ocorrendo mesmo em condições ambientais relativamente constantes ^{1 – 3.} A variabilidade das comunidades microbianas naturais surge devido à natureza altamente variável de condições ambientais. Estes processos estocásticos, por vezes, posteriormente produzir subpopulações que são muito diferentes para a média da população. Evidências recentes têm revelado que estes subpopulações fisiológicas respondem diferentemente a condições ambientais e pode produzir compostos inibidores do sinal ou que afectam dramaticamente e influenciam a ^3,4 população geral.

O estabelecimento de um método para definir a heterogeneidade dentro de uma população é fundamental para untendimento a ecologia dos micróbios em diversos ambientes e é essencial na construção de conhecimento de cianobactérias incômodo, como a Microcystis tóxica, que tem um forte impacto sobre segurança hídrica humana. Espécies como Anabaena exibir heterogeneidade morfológica em resposta a flutuações ambientais, desenvolvendo células especializadas, como heterocistos e akinetes ^2. Em contraste, as células de Microcystis não apresentam heterogeneidade morfológica óbvia durante uma resposta ao estresse. A discriminação entre as células viáveis ​​e não viáveis ​​é o aspecto mais importante de diferenciação fisiológica e permite uma melhor compreensão da dinâmica das populações microbianas. No entanto, o problema conceitual da viabilidade bacteriana em si continua a ser difícil e pouco caracterizada ^1,5,6.

A citometria de fluxo (FCM) é um método fiável e rápido de análise de células individuais. Para aumentar a compreensão do fisioterapeuta única célulalogia através FCM, sondas moleculares têm sido utilizados para distinguir uma série de processos metabólicos e bioquímicos ^7. Isto levou a um maior conhecimento das espécies em um nível celular e da população e, por sua vez ajudou a gestão dos recursos hídricos ^8,9. No entanto, os organismos diferem em termos de captação de sonda molecular e efluxo devido aos poros e bombas nas paredes celulares e membranas, que levaram a uma série de design de sonda molecular e implementação do protocolo ^6,10,11. Sondas moleculares disponíveis para fins comerciais e de pesquisa são muitas vezes fornecidos com um protocolo genérico que pode ser aplicável a um tipo de célula muito diferente. É preciso ser muito cauteloso na transferência de protocolos desenvolvidos para um tipo de célula para outra ^6, é, portanto, uma tarefa essencial para otimizar sondas moleculares de forma eficaz antes da utilização.

As sondas de verde e laranja ácidos nucleicos se ligam a ambos os ácidos nucleicos de cadeia simples e duplas com base minimalista selecioneivity e são utilizados para avaliar a integridade da membrana plasmática das células. A sonda de ácido nucleico verde tem um sinal de fluorescência marcação celular marcadamente melhorado em comparação com outras sondas moleculares, tais como os compostos à base de iodeto de propídio ^12, que também pode actuar como um indicador da viabilidade celular. O termo "viabilidade celular 'aqui assume que a degradação do DNA ocorre após a perda da integridade da membrana plasmática. As sondas de ácidos nucleicos são corantes assimétricos cianina com três cargas positivas e não podem entrar nas células com membranas íntegras sob concentrações caracterizadas, em ambos os eucariotas e procariotas ^{14,15 11,13} organismos. A ligação de uma sonda de ácido nucleico de ácidos nucleicos podem resultar em até um aumento> 500 vezes de emissões de fluorescência de sinais endógenos em células que tenham a sua integridade da membrana comprometida. Embora sondas moleculares, tais como o verde sonda de ácido nucleico pode ser um bom indicador da fisiologia da célula única, há uma necessidade To otimizar cada sonda com o organismo-alvo a que se destina, como os tempos de incubação variaram de 7 min – 30 min e concentração varia de 0,1 mM – 0,5 M em experimentos Microcystis sozinho ^15-19.

Aqui apresentamos um protocolo para otimizar os ensaios de citometria de verde e os relativamente novos laranja sondas de ácidos nucleicos (o que até à data não foram testados nas espécies de cianobactérias M.aeruginosa). A seguinte metodologia desenvolvida pode então ser transferido para outras espécies e usado como uma plataforma para optimizar protocolos de outras sondas moleculares, aumentando assim a compreensão de micróbios e o seu comportamento ecológico.

Protocol

1. Preparação da sonda molecular e Citómetro de Fluxo Dilui-se as soluções de reserva das sondas de ácidos nucleicos, que são fornecidos como uma solução a 5 mM em dimetilsulfóxido (DMSO) a alíquotas de concentrações requeridas em ultrapura filtrada H2O Armazene as sondas de ácido nucleico em condições escuras entre -5 ° C e – 25 ° C até o uso. Ligue o citômetro de fluxo e pacote de software de carga (veja a tabela de materiais / equipam…

Representative Results

Dispersão directa da luz (FSC) e luz dispersão lateral (SSC) saídas a partir de uma cultura de lote M.aeruginosa em fase exponencial fornece informação sobre o tamanho das células (diâmetro) e granularidade interna, respectivamente (Figura 1A). FSC pode discriminar células que são demasiado grandes e / ou pequenos para serem M.aeruginosa. Esta discriminação ou gating pode ser feito por dados refinação entre certos pontos da saída de um FSC…

Discussion

O aumento do número de publicações que utilizam sondas moleculares indica que dados confiáveis ​​e informativas podem ser obtidas ^{5,6,8 – 15,19,22,23.} Como ainda não há nenhuma mancha perfeita para a viabilidade das células que podem ser eficazes em todas as espécies com a mesma concentração e tempo de incubação ^6,10. Mesmo o mesmo tipo de sonda com emissões de fluorescência alteradas mostra a necessidade de estabelecer a concentração e tempo de incubação…

Materials

Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid	BD Biosciences	653155	Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min.  Followed by 2mins of sheath H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	N/A (by request)	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO