Utilizando Análise de confocal<em> Xenopus laevis</em> Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes
Summary
O manuscrito aqui fornece um simples conjunto de métodos que permitam analisar a secreção e difusão de ligantes marcados fluorescentes em Xenopus. Isto proporciona um contexto para testar a capacidade de outras proteínas para modificar a distribuição de ligando e permitindo experiências que podem dar uma visão sobre os mecanismos que regulam a gradientes de morfogénio.
Abstract
Este protocolo descreve um método para visualizar ligandos distribuídos através de um campo de células. A facilidade de expressão de proteínas exógenas, juntamente com o grande tamanho das suas células em embriões precoces, Xenopus laevis fazer um modelo útil para a visualização de ligandos GFP. MRNAs sintéticos são traduzidos eficientemente após a injecção em embriões de Xenopus fase inicial, e as injecções podem ser destinados a uma única célula. Quando combinado com um marcador de linhagem, tais como membrana tethered RFP, a célula injectada (e seus descendentes) que estão a produzir a proteína sobre-expressa pode ser facilmente seguido. Este protocolo descreve um método para a produção de fluorescente etiquetado Wnt e Shh ligandos a partir de ARNm injectado. Os métodos envolvem a miCro dissecção de explantes ectodérmicos (CAPS animais) e a análise de difusão de ligando em amostras múltiplas. Utilizando imagiologia confocal, as informações sobre a secreção de ligando e de difusão sobre um campo de células pode ser obtida. As análises estatísticas de imagens confocal fornecer dados quantitativos sobre a forma de gradientes ligando. Estes métodos podem ser úteis para pesquisadores que queiram testar os efeitos dos fatores que podem regular a forma de gradientes de morfogénio.
Introduction
Durante o desenvolvimento embrionário inicial, as células são progressivamente comprometida a seguir linhagens específicas de diferenciação: isto significa um grupo de totipotente (ou pluripotentes) as células tornam-se progressivamente limitado ao estabelecimento de populações de células progenitoras determinados para dar origem a um tipo de célula. Sinalização célula-célula é central para a regulação da especificação das linhagens durante o desenvolvimento embrionário. A manipulação destes sinais serão necessários para dirigir células estaminais em relação a determinados destinos para suportar novos tratamentos médicos.
Um número relativamente pequeno de vias de sinalização são reiterados durante o desenvolvimento, incluindo as vias de resposta à superfamília TGF (nodals e BMPs) 1-2, 3 FGFs, Wnts 4, 5 e ouriços. Estas proteínas segregadas se ligam a receptores presentes na membrana celular para activar a transdução de sinal alterando desse modo a expressão do gene e / ou o comportamento das células. A regulação apertada de sinal de celularAlling é essencial para a especificação das linhagens de células e desenvolvimento normais. Enquanto a conversa cruzada entre estas vias é importante na determinação do destino celular, um único ligante pode-se desencadear respostas diferentes em diferentes concentrações. Gradientes de morfogénios foram descritos mais de 100 anos atrás, como uma teoria para explicar como os diferentes tipos de células pode derivar de um campo de células 6. Sinalização moléculas produzidas por um grupo de células pode difundir-se ao longo de um determinado intervalo, diminuição da concentração com uma maior distância a partir da origem. As células expostas ao sinal irá responder à concentração local na sua posição no campo de células, com as células nas posições distintas de responder de forma diferente a diferentes níveis do sinal. A evidência para a existência de morfogénios vem de estudos de Drosophila embrião precoce 7 e o disco de asa 8, bem como o membro de um vertebrado 9 e 10 do tubo neural.
Métodos são necessários noterrogam como gradientes morfogénio são estabelecidos e para identificar outras moléculas importantes na regulação desses gradientes. Experimentos elegantes usando imuno-histoquímica para visualizar as proteínas endógenas in vivo no contexto de diferentes origens genéticas têm sido utilizados para investigar gradientes de morfogénio 11-12. No entanto, bons anticorpos e mutantes específicos nem sempre estão disponíveis, assim que nós descrevemos aqui um protocolo com a sobre-expressão de ligantes fluorescentes em Xenopus, para fornecer uma alternativa, método simples para dissecar como produtos de genes exógenos podem influenciar a distribuição de ligantes através de um campo de células. Xenopus laevis fornece um excelente sistema para realizar estes tipos de experimentos como os seus embriões se desenvolvem externamente para que eles sejam acessíveis nas fases iniciais. O seu grande tamanho (1-1.5mm de diâmetro) simplifica a microinjeção e manipulação cirúrgica e por blastula encena as células são fáceis de imagem como eles ainda são relativamente grande (cerca de 2081; m de diâmetro). Estudos sobre-expressão em Xenopus são simples de fazer: mRNA injetadas no embrião podem ser direcionados para determinadas células e eficiente é traduzido.
As construções Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP fluorescente marcados foram gerados usando pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 e eGFP. O péptido HA é importante incluir, não só para proporcionar uma marca molecular adicional, mas também porque é pensado para agir como um espaçador que separa as proteínas Wnt e eGFP permitindo que ambos os produtos dos genes para funcionar. A construção utilizada para a visualização de Shh foi anteriormente usado para gerar um ratinho transgénico que expressa uma proteína de fusão de Shh-eGFP 15; este foi gentilmente cedido por Andy McMahon. Importante, a etiqueta de GFP para todas as construções é clonada a 3 'da sequência de sinal de tal modo que é mantida após o processamento. Também é essencial para assegurar que a proteína final inclui sequências necessárias para tais modificações, o addition de lipídios como é o caso de Shh e Wnt ligands.The cDNAs foram subclonados no vector pCS2 + expressão que é otimizada para a Produção de mRNA sintético; que inclui um promotor de SP6 e sinal de poliadenilação (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).
O trabalho descrito aqui fornece um protocolo simples para comparar a secreção e difusão de fluorescente etiquetado Wnt e Shh marcado ligantes. Ao injectar quantidades definidas de ARNm sintético, o protocolo circumnavigates quaisquer problemas associados com a expressão variável de diferentes vectores, utilizando diferentes promotores. Estes métodos foram recentemente aplicado para investigar os efeitos do sulfato de heparano Sulf1 endosulfatase em Shh-eGFP e Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP e secreção de difusão em Xenopus 16-17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma parte essencial do presente protocolo é a geração de ligandos biologicamente activos que são normalmente processados, segregadas, e capazes de eliciar uma resposta na célula receptora, apesar de ter uma porção fluorescente ligada. É crítico para estabelecer que o produto do gene marcado fluorescentemente é biologicamente activo utilizando um ensaio apropriado. Para Shh-GFP, a capacidade de activar a expressão de PTC1 16 foi confirmada. Wnt8a tem uma capacidade extremamente potente para…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma BBSRC conceder ao eurodeputado (BB / H010297 / 1), um BBSRC quota studentship a SAR, e uma bolsa de estudo MRC para SWF.
Materials
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | N/A | N/A | Free download http://fiji.sc/Fiji |
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | N/A | http://www.photoshop.com/products |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer – M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | N/A | N/A | homemade |
| Zen lite software | Carl Zeiss | N/A | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
Referenzen
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