Использование конфокальной Анализ<em> Xenopus Laevis</em> По расследованию модуляторы Wnt и Shh морфогена градиентов
Summary
Рукопись здесь предоставляет простой набор методов для анализа секрецию и распространение флуоресцентно меченых лигандов в Xenopus. Это обеспечивает контекст для тестирования на способность других белков, чтобы изменить распределение лиганда и позволяет эксперименты, которые могут дать представление о механизмах, регулирующих морфогена градиенты.
Abstract
Этот протокол описан способ визуализации лиганды распределенными по области клеток. Легкость выражения экзогенные белки, вместе с большим размером их клеток в ранних эмбрионов, сделать Xenopus Laevis полезную модель для визуализации GFP-тегами лигандов. Синтетические мРНК эффективно переведены после инъекции в ранней стадии эмбрионов Xenopus, и инъекции могут быть направлены к одной ячейке. В сочетании с клона метки, такие как мембраны на привязи RFP, вводимый элемент (и его потомки), которые производят суперэкспрессированный белок легко может следовать. Этот протокол описывает способ получения флуоресцентно помечены Wnt и Shh лигандов из введенного мРНК. Способы включают МиCRO рассечение эктодермальных эксплантов (шапки животных) и анализа лиганда диффузии в нескольких образцах. При использовании конфокальной микроскопии, информация о секреции лиганда и диффузии над полем клеток может быть получена. Статистический анализ конфокальной изображений обеспечивают количественные данные о форме лигандов градиентов. Эти методы могут быть полезны для исследователей, которые хотят, чтобы проверить эффекты факторов, которые могут регулировать форму морфогена градиентов.
Introduction
Во раннего эмбрионального развития, клетки постепенно стремится следовать конкретные клоны дифференциации: это означает группу Тотипотентных (или плюрипотентных клеток) становятся постепенно ограничивается установления популяции клеток-предшественников определенных для возникновения одного типа клеток. Сигнализация межклеточных занимает центральное место в регуляции спецификации клонов во время эмбрионального развития. Манипулирование этих сигналов будет необходимо направить стволовые клетки к тем или иным судьбы поддерживать новые лечебные процедуры.
Относительно небольшое количество сигнальных путей повторяются в процессе развития, в том числе путей, отвечающих на надсемейства TGF (nodals и БМП) 1-2, FGFs 3 Wnts 4 и 5 Ежики. Эти секретируемые белки связываются рецепторы, присутствующие на клеточной мембране, чтобы активировать передачу сигнала таким образом изменяя экспрессию генов и / или поведение клеток. Тесная регулирование клеточной знакAlling имеет важное значение для спецификации клеточных клонов и нормального развития. В то время как перекрестные помехи между этими путей имеет важное значение при определении судьбы клеток, один лиганд может сам вызывать различные реакции при различных концентрациях. Морфогена градиенты были описаны более 100 лет назад в качестве теории, чтобы объяснить, как различные типы клеток можно получить из поля ячеек 6. Сигнальные молекулы, производимые одной группы клеток могут диффундировать в течение определенного диапазона, уменьшая концентрации с большего расстояния от источника. Клетки подвергаются сигнала будет реагировать на локальной концентрации в их положении в области клеток, с клетками в различных позициях в ответ другому к различным уровням сигнала. Доказательства существования морфогенов из исследований раннего эмбриона дрозофилы 7 и 8 диска крыла, а также позвоночных конечности 9 и нервной трубки 10.
Методы необходимы вvestigate как морфогеном градиенты устанавливаются и определить другие молекулы, важные для регулирования этих градиентов. Элегантные эксперименты с использованием иммуногистохимии для визуализации эндогенных белков в естественных условиях в контексте различных генетических фоны были использованы для расследования морфогена градиенты 11-12. Тем не менее, хорошие антитела и специфические мутанты не всегда доступны, поэтому мы здесь описывать протокол, используя избыточную экспрессию люминесцентных лигандов в Xenopus, чтобы обеспечить альтернативу, простой метод препарировать, как экзогенные генных продуктов может влиять на распределение лигандов по полю клеток. Xenopus Laevis обеспечивает отличную систему для выполнения этих типов экспериментов, их эмбрионы развиваются внешне так что они доступны на самых ранних стадиях. Их большой размер (1-1.5мм в диаметре) упрощает микроинъекции и хирургических манипуляций и бластула стадии клетки легко изображения, как они все еще относительно большой (около 2081; м в поперечнике). Избыточной экспрессии исследования в Xenopus являются просто сделать: мРНК вводят в начале эмбриона могут быть направлены на конкретных клеток и эффективно перевести.
Флуоресцентно меченые Wnt8a / Wnt11b-ГА-EGFP конструкций были получены с использованием PCS2 Wnt8a-HA 13, PCS2 Wnt11b-HA 14 и EGFP. НА, пептид важно включить не только для обеспечения дополнительного молекулярного тег, но и потому, что, как полагают, действуют как распорки, разделяющей белки Wnt и EGFP позволяет как генные продукты функционировать. Конструкция используется для визуализации Shh ранее был использован для генерации трансгенных мышей, экспрессирующих Тс-EGFP гибридный белок 15; это было любезно предоставлено Энди Мак-Магон. Важно отметить, что метка GFP для всех конструкций, клонируют 3 'сигнальной последовательности таким образом, что сохраняется после обработки. Важно также, чтобы гарантировать, что окончательный белок включает в себя последовательности, необходимые для модификации, такие в сложения ип липидов, как и в случае Shh и Wnt ligands.The кДНК субклонировали в PCS2 + вектор экспрессии, который оптимизирован для снятые с производства синтетического мРНК; она включает в себя промотор SP6 и сигнал полиаденилирования (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).
Работа описано здесь обеспечивает простой протокол для сравнения секрецию и распространение флуоресцентно помечены Wnt и Тс помечены лигандов. Вводя определенные суммы синтетического мРНК, протокол circumnavigates любые проблемы, связанные с переменным выражения из разных векторов, использующих различные промоторы. Эти методы были недавно применены для исследования последствий гепарансульфат endosulfatase Sulf1 на Тсс-EGFP и Wnt8a / секреции Wnt11b-ГА-EGFP и диффузии в Xenopus 16-17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важной частью этого протокола генерирует биологически активные лиганды, которые обычно обрабатываются, секретируемые и способны вызывать ответ в приемной камере, несмотря на наличие флуоресцентного фрагмент, присоединенный. Очень важно установить, что флуоресцентно-меченый продукт…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась BBSRC предоставить МООС (BB / H010297 / 1), аспирантуру квот BBSRC Сар, и студенчество MRC к SWF.
Materials
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | N/A | N/A | Free download http://fiji.sc/Fiji |
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | N/A | http://www.photoshop.com/products |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer – M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | N/A | N/A | homemade |
| Zen lite software | Carl Zeiss | N/A | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
Referenzen
- Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
- Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
- Pownall, M. E., Isaacs, H. V. . FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, 1-75 (2010).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
- Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
- Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
- Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
- Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
- Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
- Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
- Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
- Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
- Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Entwicklungsbiologie. 320 (2), 436-445 (2008).
- Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Entwicklungsbiologie. 391 (2), 207-218 (2014).
- Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
- Dytham, C. . Choosing and using statistics : A biologist’s guide. , (2005).
- Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
- Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
- Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
- Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
- Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
- McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
- Schohl, A., Fagotto, F. B. e. t. a. -. c. a. t. e. n. i. n. MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
- Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
- Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2010).
