Electrotaxis Studi di polmone cellule tumorali usando un Multicanale Dual-campo elettrico Microfluidic Chip
Summary
Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.
Abstract
Il comportamento di migrazione delle cellule direzionale in una corrente di campo elettrico diretto (dcEF) è indicato come electrotaxis. Il ruolo significativo fisiologico dcEF nel guidare il movimento delle cellule durante lo sviluppo embrionale, la differenziazione cellulare e la guarigione della ferita è stata dimostrata in molti studi. Applicando chip microfluidici a un saggio electrotaxis, il processo di indagine è abbreviato e errori sperimentali sono ridotti al minimo. Negli ultimi anni, i dispositivi microfluidici fatti di sostanze polimeriche (ad esempio, polimetilmetacrilato, PMMA, o acrilico) o polidimetilsilossano (PDMS) sono stati ampiamente utilizzati nello studio delle risposte delle cellule alla stimolazione elettrica. Tuttavia, a differenza dei numerosi passaggi necessari per fabbricare un dispositivo PDMS, la costruzione semplice e rapida delle micro acrilici fl truciolo uidic rende adatto sia prototipazione dispositivo e produzione. Tuttavia nessuno dei dispositivi riportati facilitare lo studio efficace della sostanza chimica simultanea e DCEF effetti sulle cellule. In questo rapporto, descriviamo la nostra progettazione e fabbricazione di un multicanale base acrilica a doppio campo elettrico (MDF) chip per studiare l'effetto concomitante di chimica e di stimolazione elettrica sulle cellule tumorali del polmone. Il chip MDF fornisce otto combinazioni di stimolazioni elettriche / chimiche in un singolo test. Il chip non solo riduce notevolmente il tempo richiesto sperimentale ma aumenta anche la precisione in electrotaxis studi.
Introduction
Il comportamento delle cellule aderenti muovono verso un anodo o catodo in una corrente di campo elettrico diretto (dcEF) è indicato come electrotaxis. Il comportamento electrotactic delle cellule svolge un ruolo significativo nella embriogenesi, rigenerazione dei nervi, e la guarigione della ferita. 1 Le cellule tumorali come le cellule tumorali della prostata di ratto, cellule del cancro al seno 2, 3 e del polmone di cellule di adenocarcinoma 4-8 hanno dimostrato movimento electrotactic sotto un dcEF applicato . L'EF fisiologica è stata misurata nei tessuti della ghiandola. 9,10 Electrotaxis è stata riportata anche in cellule tumorali ghiandola associate. 2,3 Nel loro insieme, le electrotaxis di cellule tumorali è considerata un fattore di metastasi. 11 Controllo della guida elettrica di le cellule tumorali sotto dcEF può essere un approccio potenziale per il futuro trattamento del cancro. Tuttavia, oggi, il meccanismo molecolare dettagliato della electrotaxis rimane controverso. Pertanto, un'indagine sulla influence di stimolazione elettrica sulla migrazione delle cellule del cancro può facilitare lo sviluppo di strategie per il trattamento del cancro.
Di recente, i dispositivi bio-microfluidica sono stati fabbricati per studiare le risposte cellulari a fluire forza di taglio, 12 gradienti chimici, 13 e stimoli elettrici 4 in vitro. La fabbricazione di dispositivi bio-microfluidica con polidimetilsilossano (PDMS) o polimetilmetacrilato (PMMA, noto anche come acrilico) ha ridotto con successo il tasso di fallimento di tali esperimenti. Inoltre, utilizzando dispositivi microfluidici base acrilica come prototipo per lo studio soggetti biologici è più semplice rispetto all'utilizzo di PDMS chip. Diverse funzioni nei dispositivi a base acrilica sono stati sviluppati per electrotaxis studio. Tuttavia, nessuno dei disegni precedenti sono in grado di testare contemporaneamente gli effetti di varie condizioni chimiche e il campo elettrico sulle cellule per electrotaxis studio. Così, abbiamo sviluppato un dispositivo microfluidica-multichannel dual-campo elettrico (MDF)-chip contenente quattro canali indipendenti, cultura e otto differenti condizioni sperimentali in un unico chip.
Il chip MDF base acrilica, prima volta da Hou et al., 8 integra stimolazione elettrica e diversi canali isolati chimicamente. Questi canali isolati chimicamente possono essere utilizzati per la cultura diversi tipi di cellule in un esperimento. La dcEF nei canali viene prodotta da un alimentatore elettrico. Due campi elettrici indipendenti, uno con applicazione di forza del campo elettrico (EFS) e un altro con 0 EFS, sono condotte in ciascun canale chimicamente isolato. In questo modo, il chip fornisce EF coesistenti meglio controllato e stimolazione chimica. Inoltre, i risultati della simulazione numerica della diffusione chimica all'interno del chip MDF indicano che non si è verificata una contaminazione incrociata tra i canali, dopo un periodo sperimentale 24 hr. 8
Rispetto al device riportato da Li et al., 14 il chip MDF fornisce un'area culturale più grande, che permette ulteriori analisi biochimica delle cellule stimolate elettricamente. Inoltre, con grande area di osservazione del chip MDF, più cellule possono essere osservati nel test, per cui l'analisi della velocità di migrazione o di direzionalità delle cellule stimolate elettricamente è più accurata. I modelli di chip singolo canale di studi precedenti riportati da Huang et al. 4 e Tsai et al. 15 consentono solo un tipo di cellula o chimica da testare. Tuttavia, il chip MDF può essere usato per studiare gli effetti di varie sostanze chimiche su electrotaxis, nonché gli effetti della stimolazione elettrica su diversi tipi di cellule. In altre parole, il chip MDF consente lo studio di dose efficace delle dipendenze chimiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo trovato il processo di aderire adattatori acrilico su livello 1 del chip MDF di essere ingannevole. L'applicazione di appena 1 o 2 ml di colla super è sufficiente per aderire saldamente all'adattatore sul chip MDF. Grandi quantità di colla comportato un polimerizzazione incompleta del super colla e mancato adempimento. Una volta che gli adattatori acrilici erano saldamente rispettati sul chip MDF, perdite di liquido nel sistema microfluidico raramente verificato. Inoltre, O / N incubazione all'inte…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24×60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| Teflon tube | HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan | UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING | outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scientific |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| indium tin oxide glass (ITO glass) | AimCore Technology Co., Ltd | TN/STN, ≦10Ω | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
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