Электротаксис Исследования клетки легких рака с использованием многоканального Dual-электрического поля микрофлюидных Chip
Summary
Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.
Abstract
Поведение направленной миграции клеток под постоянным током электрического поля (dcEF) упоминается как электротаксис. Значительную роль физиологического dcEF в руководстве движения клеток во время эмбрионального развития, дифференциации клеток и заживление ран было продемонстрировано во многих исследованиях. Применяя микрожидкостных фишки на электротаксис анализа, процесс расследования сокращается и экспериментальные ошибки к минимуму. В последние годы микрофлюидальные устройства изготовлены из полимерных веществ (например, полиметилметакрилат, ПММА, или акриловую) или полидиметилсилоксана (ПДМС) широко используются при изучении ответов клеток на электрическую стимуляцию. Однако, в отличие от многочисленных шагов, необходимых для изготовления устройства PDMS, простой и быстрый строительство акриловых микро фл uidic чип делает его пригодным как для прототипирования и производства устройств. Тем не менее, ни один из представленных устройств не способствовать эффективному исследование одновременного химического и DCEF воздействие на клетки. В этом докладе мы описываем нашу конструкцию и изготовление акриловой основе многоканального двойного электрического поля (MDF) обломок расследовать одновременный эффект химической и электрической стимуляции на клетках рака легких. Чип МДФ имеет восемь комбинаций электрических / химические раздражения в одном тесте. Чип не только значительно сокращает необходимое время эксперимента, но также увеличивает точность электротаксис исследований.
Introduction
Поведение адгезивных клеток, движущихся по направлению к анода или катода под постоянным током электрического поля (dcEF) упоминается как электротаксис. Electrotactic поведение клеток играет важную роль в эмбриогенезе, регенерации нерва, и заживления ран. 1 Опухолевые клетки, такие как раковые клетки крысы простаты, рак молочной железы клеток 2, 3 и легких клетки аденокарциномы 4-8 показали electrotactic движение при приложенном dcEF , Физиологический EF была измерена в железе тканей. 9,10 электротаксис Также сообщалось в железе ассоциированный опухолевых клеток. 2,3 Взятые вместе, электротаксис раковых клеток, как полагают, является фактором метастазы. 11 Управление электрического руководство раковые клетки под dcEF может быть потенциальным подходом для будущего лечения рака. Тем не менее, сегодня, подробный молекулярный механизм электротаксис остается спорным. Таким образом, исследование инфluence электрической стимуляции по миграции раковых клеток может способствовать развитию стратегий для лечения рака.
Недавно, био-Микрожидкостных устройства были изготовлены для изучения клеточных ответов течь силы сдвига, 12 химических градиентов, 13 и электрических стимулов 4 в пробирке. Изготовление био-Микрожидкостных устройств, использующих полидиметилсилоксана (PDMS) или полиметилметакрилат (ПММА, также известный как акрил) успешно снизили интенсивность отказов таких экспериментов. Кроме того, с помощью акриловых основе микрожидкостных устройства в качестве прототипа для исследования биологических предметы проще, чем с помощью PDMS чипов. Различные функции в устройствах на акриловой основе были разработаны для электротаксис исследования. Тем не менее, ни один из предыдущих конструкций не способны одновременно испытать влияние различных химических условий и электрического поля на клетки для электротаксис исследования. Таким образом, мы разработали устройство микрожидкостных-му вltichannel двойного электрического поля (MDF) чип, содержащий четыре независимых каналов культура и восемь различных экспериментальных условиях в одном чипе.
Акриловый основе МДФ чип, впервые сообщил Хоу и др., 8 интегрируется электрической стимуляции и несколько химически изолированных каналов. Эти химически изолированные каналы могут быть использованы для культуры различных типов клеток в одном эксперименте. DcEF в каналах производится по сети электропитания. Два независимых электрических полей, одна с прикладной напряженности электрического поля (EFS), а другой с 0 EFS, проводятся в каждом химически изолированный канал. Таким образом, микросхема обеспечивает более контролируемый сосуществующих EF и химическое раздражение. Более того, результаты численного моделирования химической диффузии внутри чипа MDF указать, что перекрестное загрязнение не происходило между каналами после экспериментального периода в 24 ч. 8
По сравнению с ДевиCE сообщает Li и др., 14 чип МДФ обеспечивает большую площадь культуры, которая позволяет для дальнейшего биохимического анализа электрически стимулированных клеток. Кроме того, с большей площадью наблюдения чипа МДФ, в несколько ячеек можно наблюдать в тесте, так что анализ скорости миграции или направленности электрически стимулированных клеток является более точным. Чип конструкций одноканальные предыдущих исследований, представленных Хуанг и др. 4 и Цай и др. 15 позволяют только один тип клеток или химических веществ, подлежащих испытанию. Тем не менее, чип МДФ могут быть использованы для изучения влияния различных химических веществ на электротаксис, а также последствия электрической стимуляции на разных типах клеток. Другими словами, чип МДФ позволяет эффективно изучении зависимостей химических доз.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы нашли процесс присоединения акриловых адаптеры на уровне 1 чипа МДФ будет сложно. Применение 1 до просто 2 мкл супер клей достаточно прочно придерживаться адаптер на чипе МДФ. Большие количества клея в результате неполного полимеризации супер клей и несоблюдение. После того, как акри…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is financially supported by the Ministry of Science and Technology, Taiwan (Contract no. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) and the Research Program on Nanoscience and Nanotechnology, Academia Sinica, Taiwan.
Materials
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24×60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| Teflon tube | HENG YI ENTERPRISE CO., LTD., Taiwan | UPTB_06, DUPONT TEFLON BRAND RESIN FEP TUBING | outer diameter 1/16 in., inner diameter 0.03 in.; Upchurch Scientific |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| indium tin oxide glass (ITO glass) | AimCore Technology Co., Ltd | TN/STN, ≦10Ω | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
Referenzen
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
- Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
- Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
- Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
- Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
- Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
- Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
- Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
- Cheng, J. -. Y., Yen, M. -. H., Hsu, W. -. C., Jhang, J. -. H., Young, T. -. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
- Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).
