مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين<em> في فيفو</em
Summary
مناعي لونين هي تقنية قوية لتحديد المواقع DNA من البروتينات في الجسم الحي نبات الأرابيدوبسيس ملزمة. ويشمل هذا الإجراء لونين عبر ربط والتشرذم، مناعي مع الأجسام المضادة انتقائية ضد البروتين من الفائدة، وتحليل QPCR من الحمض النووي ملزمة. نحن تصف مقايسة الشذرة بسيط الأمثل لمحطات نبات الأرابيدوبسيس.
Abstract
Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.
Introduction
خلال السنوات الأخيرة تم تطوير مجموعة واسعة من الأدوات الجينية، الجزيئية والجينوم في أنواع نموذج نبات الأرابيدوبسيس thaliana. هذه التكنولوجيا قد سهلت بشكل كبير من التقدم في فهم كيفية تنظيم تطوير المصنع. ومن بين العمليات التنموية المدروسة باستخدام نبات الأرابيدوبسيس كنموذج، والسيطرة الوراثية من الوقت المزهرة تم تحليلها على نطاق واسع. وقد أظهرت هذه الدراسات أن النباتات تعدل بدقة متناهية وقت المزهرة في استجابة لمنبهات الذاتية مثل الهرمونات وعمر النبات، وأيضا لإشارات البيئية مثل الإضاءة ودرجة الحرارة التي تزامن المزهرة الوقت مع الدورة الطبيعية للمواسم 1، 2. وقد تم عزل وتوصيف المسوخ نبات الأرابيدوبسيس مع بعض التعديلات في وقت الإزهار حاسما في كشف شبكة معقدة من الجينات التي تنظم للمرة المزهرة استجابة لعوامل داخلية والبيئية. هذه الدوائر الجينيةمتكاملة على مستوى عدد قليل من الجينات الرئيسية التي تكون بمثابة مفاتيح المزهرة، والتوقيت الدقيق لبدء الأزهار يعتمد على ميزان المزهرة تعزيز وقمع الأنشطة التي تعمل المنبع من الجينات تكامل الأزهار 1،3.
وقد كشفت توصيف وظيفي من الجينات التي تم تحديدها لدورها في مراقبة المزهرة بدء، وبمساعدة من استخدام الأخير من النهج الجينومية، والدور المركزي للتنظيم النسخي في التشكيل من الوقت المزهرة. في الواقع، العديد من الجينات سيد المزهرة ترميز عوامل النسخ 4. وبالإضافة إلى ذلك، هناك عدد من لونين مجمعات البروتين إعادة تؤثر على التعبير عن الجينات سيد المزهرة. تحول عدد من المسوخ نبات الأرابيدوبسيس معزولة لمن تغير الوقت المزهرة إلى تحمل طفرات في جينات ترميز مجموعة متنوعة من معدلات الكروماتين. و remodelers لونين مختلفة إدخال تعديلات posttranslational في هيستونالبريد ذيول، أعد nucleosomes نسبة إلى DNA أو تبادل الهستونات الكنسي من قبل المتغيرات هيستون ضرورية لتنظيم السليم لالمزهرة في نبات الأرابيدوبسيس 5،6. بعض هذه الأنشطة إعادة عرض لونين تحفيز ترسب أو إزالة التعديلات التساهمية مثل أستلة أو مثيلة في بقايا هيستون محددة. يتم التعرف على هذه العلامات هيستون تحديدا مؤثرات المتخصصة التي تجند أخرى مجمعات ونين إعادة عرض، عوامل النسخ أو مكونات الآلات النسخي لتنظيم النشاط النسخي الجينات المزهرة.
لونين مناعي (رقاقة) يسمح بتحديد المواقع في الجسم الحي للبروتينات ذات الاهتمام ملزم الحمض النووي (الشكل 1). يأخذ هذا الإجراء الاستفادة من قدرة بعض المواد الكيميائية إلى عبر الارتباط البروتينات على الحمض النووي. مما أدى المجمعات الحمض النووي والبروتينات ويمكن بعد ذلك immunoprecipitated باستخدام الأجسام المضادة الآغا محددةالعوامل انست النسخ والبروتينات ملزم لونين، أو تعديلات معينة والحواتم مغاير (يشار اليه عادة باسم "العلامات") التي تعلق على البروتين في الاختيار. الحمض النووي تنقيته من هذه immunoprecipitates يمكن استخدامها كقالب في PCR (QPCR) ردود فعل الكمية لتقييم لإثراء تسلسل معينة من الاهتمام. وبهذه الطريقة، يمكن إنشاء مواقع الربط من عوامل النسخ أو توزيع علامات هيستون في جينات معينة 7،8. وبالإضافة إلى ذلك، جنبا إلى جنب مع الجيل التالي من التسلسل (خ ع) التي تمكن التسلسل الموازي ضخمة، جعلت تكنولوجيا رقاقة الممكن تحديد الجينوم على نطاق مواقع الربط من عوامل النسخ فضلا عن المناظر الطبيعية epigenomic الكشف عن التعديلات هيستون. وعلاوة على ذلك، فإن التحليل في وقت واحد في التعبير الجيني يسمح مراقبة كيفية الربط المنظمين النسخي أو ترسب معينة علامات هيستون ترتبط مع النسخي activiتاي من الجينات 9.
وقد سمح باستخدام بروتوكولات الشذرة في نبات الأرابيدوبسيس تقييم الأثر أن مجموعة متنوعة من المنظمين النسخي لها بشأن تنظيم لونين الجينات سيد المزهرة وكيف يمكن لهذه التغيرات الهيكلية تؤثر التعبير الجيني 5،6. وأظهرت النتائج السابقة أن انشقاقه المبكر نبات الأرابيدوبسيس مكان في أيام قصيرة (EBS) بمثابة كاظمة المزهرة والمسوخ في هذا المعرض الجينات تسارع المزهرة وupregulation من الجين سيد المزهرة FT. بالإضافة إلى ذلك، الخسارة من وظيفة الطفرات في FT قمع تماما النمط الظاهري المزهرة في وقت مبكر من النباتات EBS متحولة، مشيرا إلى أن FT مطلوب من أجل ازدهار سابق لأوانه من المسوخ EBS وأن EBS هو ضروري لقمع هذا الجين سيد المزهرة 10 11. بترميز EBS البروتين التي تحتوي على الدكتوراه التي يمكن أن تربط خصيصا هيستون H3 البروميد وtrimethylated في الالبريد يسين 4 بقايا (H3K4me2 / 3)، مما يشير إلى دور لEBS في قمع بوساطة لونين من FT 12. أظهر استخدام نهج الشذرة أن نبات الأرابيدوبسيس التي تحتوي على البروتين الدكتوراه EBS 10،11 يربط المناطق التنظيمية من الأزهار FT تكامل الجيني لقمع التعبير عنها 12. وأظهرت بيانات إضافية تم الحصول عليها من خلال استخدام تكنولوجيا رقاقة ما هو مطلوب هذا البروتين للحفاظ على مستويات منخفضة من أستلة هيستون، وهي السمة المميزة النسخ نشط، في لونين من هذا الجين سيد المزهرة خلال المراحل الأولى من تطوير نبات الأرابيدوبسيس. هذه الملاحظات، جنبا إلى جنب مع بيانات التعبير الجيني والجينات، وتثبت أن هذا نبات الأرابيدوبسيس الدكتوراه التي تحتوي على البروتين له دور مركزي في ضبط الوقت المزهرة عن طريق تحوير التعبير عن تكامل جين الأزهار FT 12. العمل المقدم هنا يوفر وسيلة الأمثل مفيد ليس فقط لتحليل الهستونات ولكن أيضا لأغراض أخرىلونين المرتبطة البروتينات، ومع زيادة الكفاءة وتقليل الوقت التجريبية. وعلاوة على ذلك، يوضح هذا التقرير كيف قدمت استخدام بروتوكولات الشذرة رؤى جديدة في العلاقة بين التغيرات في تعديلات لونين والدول النسخي من جينات النباتات، وكيف يمكن لهذه الآليات بوساطة لونين من تأثير السيطرة التعبير الجيني في بداية المزهرة في نبات الأرابيدوبسيس.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الشذرة الموصوفة هنا هو أسلوب استنساخه وقوية لتحليل التفاعلات بين البروتينات وتسلسل الحمض النووي محددة في الجسم الحي في النباتات نبات الأرابيدوبسيس. A تحديد الناجح لمواقع الربط للبروتينات ذات الاهتمام يتطلب اختيار كافية من أجهزة النبات أو مراحل النمو …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Economìa y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).
Materials
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads® magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton™ X-100 Surfact-Amps™ Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack – DynaMag™-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex® 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler® 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
Referenzen
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
- Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
- He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
- Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
- Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
- Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
- Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
- Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
- Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998 (2012).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
- Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
- Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
- Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).
- Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
- Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
- Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).
