애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em> 생체</em
Summary
염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다.
Abstract
Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.
Introduction
최근 몇 년 동안, 분자 적 유전자 및 게놈 툴의 다양한 모델 종 애기 장대에서 개발되어왔다. 이 기술은 식물 개발을 규제하는 방법을 이해하는 엄청난 발전을 촉진했다. 모델로 애기 장대를 이용하여 연구 개발 과정 중, 꽃이 피는 시간의 유전 적 제어가 광범위하게 분석하고있다. 이 연구는 식물은 호르몬과 식물의 나이 내생 단서에 대한 응답으로 꽃을 매우 정밀하게 시간을 조절하는 것으로 나타났습니다, 또한 시즌 1의 자연주기와 시간을 꽃 동기화 등 광주 및 온도 등의 환경 신호에, 2. 개화시기의 변화와 애기 돌연변이의 분리 및 특성 규명은 내인성 및 환경 인자에 응답하여 개화시기를 조절하는 유전자의 복잡한 네트워크를 공개에서 결정되었다. 이 유전자 회로는꽃의 스위치로서 작용 몇 마스터 유전자 수준에서 통합 및 꽃 개시의 정확한 타이밍은 개화 촉진 및 꽃 적분기 유전자 1,3 상류 작업 활동을 억압의 균형에 의존한다.
게놈 접근의 최근 사용에 의해 원조 꽃 개시의 제어에서의 역할에 대해 확인 된 유전자의 기능적 특성은, 꽃이 피는 시간의 변조에 전사 조절의 중심 역할을 계시했다. 사실, 꽃 인코딩 전사 마스터 유전자의 대부분은 4 요인. 또한, 크로 마틴 리모델링 단백질 복합체의 수는 개화 마스터 유전자의 발현에 영향을 미친다. 자신의 변경된 꽃 시간 동안 고립 된 애기 장대 돌연변이 체의 수는 염색질 수정의 다양한 암호화하는 유전자의 돌연변이를 가지고 밝혀졌다. 히스톤의 번역 후 변형을 소개 다른 염색질 remodelers전자 꼬리는 DNA에 비해 뉴 클레오의 위치를 변경하거나 애기 5,6에서 꽃의 적절한 규제 히스톤 변형에 의해 필요한 표준 히스톤을하고 있습니다 교환한다. 이 크로 마틴 리모델링 활동 중 일부는 증착 또는 특정 히스톤 잔류 물에 아세틸 또는 메틸화와 같은 공유 수정의 제거를 촉진. 이러한 히스톤 마크는 특히 꽃 유전자의 전사 활성을 조절하는 다른 크로 마틴 리모델링 복합체, 전사 인자 또는 전사 기계의 구성 요소를 모집 전문 이펙터에 의해 인식됩니다.
염색질 면역 침전 (칩)는 생체 내 DNA 결합 관심의 단백질 사이트를 (그림 1)의 확인을 할 수 있습니다. 이 절차는 DNA에 크로스 링크에 특정 화학 물질의 기능의 단백질을 이용한다. 얻어진 DNA 단백질 복합체는 다음 AGA 특정 항체를 이용하여 면역 침전 될 수있다이달 전사 인자, 염색질 – 결합 단백질, 또는 특정 변형 및 이종 에피토프는 원하는 단백질을 부착 (일반적으로 "태그"라 함). 이러한 immunoprecipitates로부터 정제 DNA는 관심있는 특정 서열의 엔리치 평가하기 위해 정량적 PCR (qPCR에) 반응에서 주형으로서 사용될 수있다. 이러한 방식으로, 전사 인자의 결합 부위 또는 특정 유전자 히스톤 마크들의 분포는 7,8를 설립 할 수있다. 또한, 대규모 병렬 시퀀싱을 가능 차세대 시퀀싱 (NGS)와 결합 칩 기술은 전사 인자의 결합 부위뿐만 아니라 히스톤 변형 공개 에피 지노믹스 풍경 게놈 전체의 식별을 가능하게하고있다. 또한, 유전자 발현의 동시 분석을 전사 조절기의 결합 또는 특정 히스톤 마크 증착 activi 전사와 상관 관계가 어떻게 모니터링 허용유전자 (9)의 타이.
애기 장대의 칩 프로토콜의 사용은 전사 레귤레이터 다양한 염색질 개화 마스터 유전자의 조직 및 방법이 구조적 변화는 유전자 발현에 영향을 5,6에 미치는 영향을 평가할 수있다. 이전 결과 짧은 일 애기 궤적 조기 BOLTING (EBS)이이 유전자 쇼에서 꽃과 꽃 FT의 마스터 유전자의 상향 조절의 가속도를 꽃과 돌연변이의 억제 자 역할을 것을 보여 주었다. 또한, FT의 기능 상실 돌연변이는 완전히 FT는 EBS 돌연변이 조기 개화과 EBS 10 꽃이 마스터 유전자의 억제에 필요한 것으로 요구 된 것을 나타내는, EBS 돌연변이 식물의 개화 표현형을 억제 , 11. EBS는 특히 히스톤 H3의 디 바인딩과 일에 트라이 메틸화 수있는 PHD-포함하는 단백질을 암호화FT (12)의 크로 마틴 매개 억압에서 EBS의 역할을 제안하는 전자 라이신 4 잔류 물 (/ 3 H3K4me2). 칩 방식의 사용은 애기 PHD 함유 단백질 EBS 10,11는 식 (12)을 억제하는 꽃 적분기 FT 유전자의 조절 영역을 결합하는 것을 보여 주었다. 칩 기술을 이용하여 만들어진 추가의 데이터는이 단백질이 애기 개발의 초기 단계에서 꽃이 마스터 유전자의 크로 마틴의 히스톤 아세틸 화, 활성화 된 전사의 특징 인 낮은 수준을 유지하기 위해 요구되는 것으로 나타났다. 함께 유전자 및 유전자 발현 데이터와 이러한 관찰은이 애기 PHD – 함유 단백질이 꽃 적분기 (12)의 FT 유전자 발현을 변조시킴으로써 개화시기의 미세 조정에 중심적인 역할을 가지고 있음을 보여준다. 여기에 제시된 작품은 히스톤의 분석뿐만 아니라 다른 용뿐만 아니라 유용한 최적화 된 방법을 제공염색질은 단백질 관련, 증가 된 효율 및 실험 시간을 단축. 또한,이 보고서 칩 프로토콜의 사용은 애기 장대의 개화의 발병에 유전자 발현 제어 충격이 염색질 – 중재 메커니즘 염색질 변형의 변화 및 식물 유전자의 전사 상태 사이의 관계에 새로운 통찰력을 제공하는 방법과 어떻게 나타낸다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 칩 프로토콜은 아라비돕시스 식물의 생체 내에서 단백질과 특정 DNA 서열 사이의 상호 작용을 분석 재현성 강력한 기술이다. 관심의 단백질 결합 부위의 성공적인 식별 관련 상호 작용이 실제로 일어나고있는 식물 기관 또는 발달 단계의 적절한 선택이 필요합니다. 또, 식물 재료의 적절한 고정 및 초음파 처리에 의해 최적의 염색질의 전단을 수득하는 것이 중요하다. 선택?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Economìa y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).
Materials
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads® magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton™ X-100 Surfact-Amps™ Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack – DynaMag™-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex® 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler® 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
Referenzen
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
- Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
- He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
- Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
- Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
- Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
- Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
- Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
- Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998 (2012).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
- Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
- Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
- Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).
- Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
- Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
- Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).
