Production de l'homme Norovirus SAILLANTES Domaines dans<em> E. coli</em> Pour X-ray Crystallography

Summary

Ici, nous décrivons une méthode pour exprimer et purifier les norovirus de haute qualité en saillie (P) dans les domaines E. coli pour une utilisation dans les études de cristallographie aux rayons X. Cette méthode peut être appliquée à d' autres domaines calicivirus P, ainsi que des protéines non structurales, à savoir., Protéines du génome viral lié (VPg), la protéase et l' ARN polymérase dépendante de l' ARN (RdRp).

Abstract

La capside norovirus est constituée d'une seule protéine structurale majeure, appelée VP1. VP1 est subdivisé en une coque (S) et un domaine en saillie (P) domaine. Le domaine S forme un échafaudage contiguë autour de l'ARN viral, tandis que les formes P de domaine de pointes virales sur le domaine S et contient déterminants pour les interactions d'antigénicité et de la cellule hôte. Le domaine P se lie structures d' hydrates de carbone, ie., Les antigènes du groupe histo-sang, qui sont considérés comme importants pour les infections à norovirus. Dans ce protocole, nous décrivons un procédé de production norovirus P domaines de haute qualité avec des rendements élevés. Ces protéines peuvent alors être utilisées pour la cristallographie aux rayons X et ELISA afin d'étudier les interactions d'antigénicité et de la cellule hôte.

Le domaine P est d'abord clone dans un vecteur d'expression et exprimé dans des bactéries. La protéine est purifiée en utilisant trois étapes qui consistent à immobilisés Chromatographie d'affinité d'ions métalliques et une Chromatographie d'exclusion de taille. Dansprincipe, il est possible de cloner, exprimer, purifier et cristalliser les protéines en moins de quatre semaines, ce qui rend ce protocole, un système rapide pour analyser les nouvelles souches émergentes de norovirus.

Introduction

Les norovirus humains sont la principale cause de gastro – entérite aiguë dans le monde ^1. Ces virus appartiennent à la famille Caliciviridae, dont il existe au moins cinq genres, y compris les norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus et Nebovirus. En dépit de leur fort impact sur le système de santé et une large distribution, l'étude des norovirus humains est entravée par l'absence d'un système de culture cellulaire robuste. À ce jour, il n'y a pas de vaccins approuvés ou stratégies antivirales disponibles.

La protéine majeure de capside norovirus, appelé VP1, peut être divisé en une coque (S) et un domaine en saillie (P) domaine ^2. Le domaine P est connecté au domaine S par une région charnière flexible (H). Le domaine S forme un échafaudage autour de l'ARN viral, alors que le domaine P constitue la partie la plus extérieure de la capside virale. Le domaine P assemble en dimères biologiquement pertinentes lorsqu'elle est exprimée dans des bactéries. P dimer interagit avec les structures d'hydrates de carbone, appelés antigènes des groupes sanguins (histo-HBGA) qui sont présents comme des antigènes solubles dans la salive et dans certaines cellules hôtes ^3. Le P domain-HBGA interaction est considéré comme important pour l' infection ^4. En effet, un rapport récent a révélé l'importance de HBGA synthétiques ou HBGA exprimant des bactéries pour l' infection à norovirus humain in vitro ^5.

Les études actuelles concernant la fixation de la cellule hôte de norovirus sont principalement réalisées avec des particules de type virus (VLP) qui peuvent être exprimées dans des cellules d' insectes ou des domaines P recombinants exprimés dans Escherichia coli (E. coli). Pour comprendre les interactions P domaine HBGA à résolution atomique, des structures complexes P domaine-HBGA peuvent être résolus en utilisant cristallographie aux rayons X. Ici, nous décrivons un protocole pour l'expression P de domaine et de purification qui permet la production de P domaine en grande quantité et de la qualité à utiliser pour crystall X-rayography. En outre, cette méthode peut être appliquée à d'autres domaines calicivirus P et les protéines non structurales.

Le domaine P est le codon-optimisé pour E. expression coli et clone dans un vecteur de transfert standard. Le domaine P est ensuite re-cloné dans un vecteur d'expression qui code pour une polyhistidine (His) marqueur et une protéine de liaison au mannose (MBP), qui sont suivies par un site de clivage de protéase. MBP-His-protéine P domaine de fusion est exprimé dans E. coli, suivie par trois étapes de purification. La protéine de fusion MBP-domaine His-P est purifié en utilisant une Chromatographie d'affinité d'ions métalliques immobilisés (IMAC). Ensuite, la protéine de fusion est clivée par le rhinovirus humain (HRV) -3C protéase et le domaine P est séparé de la MBP-His par une étape supplémentaire de purification IMAC. Enfin, le domaine P est purifié en utilisant une Chromatographie d'exclusion de taille (SEC). Le domaine P purifié peut ensuite être utilisé pour la cristallographie aux rayons X. Dépistage des conditions de cristallisation des protéines est performé avec des kits de dépistage disponibles dans le commerce en utilisant différentes concentrations de protéine P de domaine. La croissance cristalline est observée et les conditions les plus prometteuses sont optimisées.

Avec les procédés décrits ici, il est possible de passer de gène à la protéine à la structure en moins de quatre semaines. Par conséquent, notre méthode d'expression P de domaine, la purification et la cristallisation est approprié pour étudier l'interaction norovirus-hôte au niveau moléculaire et de fournir des données importantes pour aider à la conception et la drogue dépistage mise à jour vaccin.

Protocol

1. P Domain Cloning Déterminer la région P domaine de codage par alignement de séquences des souches de norovirus (par exemple, la souche GII.10, GenBank: AF504671, pdb-ID: 3ONU) 6. En outre, retirer la région flexible à l'extrémité C-terminale du domaine P (figure 2A). Optimiser les codons d' ADN pour E. expression coli et comprennent BamHI (N-terminal) et Notl (C-terminal) des sites de restriction afin de sous-clone le domaine P région c…

Representative Results

Le schéma du protocole décrit est représenté sur la figure 1. Le protocole comprend 6 parties principales qui comprennent le clonage du gène cible, l' expression d' une purification en trois étapes, et la cristallisation. La figure 2 illustre la conception de la construction d'expression (CE) , et caractéristiques du vecteur d'expression pMalc2x. La séquence du site de clonage multiple (MCS) du vecteur pMalc2x montre restriction e…

Discussion

Ici, nous décrivons un protocole pour l'expression et la purification de P domaines de norovirus en haute qualité et la quantité. Les norovirus sont pas bien étudiés et les données structurelles sont continuellement nécessaires. À notre connaissance, la production de domaine P en utilisant d' autres protocoles (par exemple, P domaines de la TPS-étiqueté) a été problématique, à ce jour, et les données structurelles suffisantes sur l' interaction norovirus-hôte ont été portées dispa…

Materials

P domain DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	On request
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Column Chromatography Column	Bio-Rad	7372512	2.5 cm x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	various	cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protease	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	SEC column
JCSG Core suites	Qiagen	various	4 screens with each 96 wells
Carbohydrates	Dextra Laboratories, UK	various	Blood group products