인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에<em> E. 대장균</em> X 선 결정학에 대한
Summary
여기서는 표현 E.의 (P) 영역을 돌출 고품질 노로 바이러스를 정제하는 방법을 설명 대장균 X 선 결정학 연구에 사용. 이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역뿐만 아니라, 비 구조 단백질에 적용 할 수있는 예. 바이러스 게놈의 단백질 – 결합 (VPG), 프로테아제 및 RNA 의존적 RNA 폴리머 라제 (RDRP).
Abstract
노로 바이러스의 캡시드는 하나의 주요 구조 단백질로 구성되어, VP1 불린다. VP1은 쉘 (S) 영역 및 돌출부 (P) 영역으로 나누어진다. 의 S 도메인은 P 도메인 형태의 S 도메인에 바이러스 성 스파이크 반면, 바이러스 성 RNA 주위에 연속 골격을 형성하고 항원 및 호스트 세포의 상호 작용에 대한 결정을 포함한다. 는 P 영역, 즉., 생각된다 히스 – 혈액형 항원이, 노로 바이러스 감염에 대한 중요한 것으로, 탄수화물 구조를 결합한다. 이러한 프로토콜에서는, 고 수율 고품질 노로 바이러스의 P 영역의 제조 방법을 설명한다. 이러한 단백질은 항원 후 호스트 세포 상호 작용을 연구하기 위해 X 선 결정학 및 ELISA에 사용될 수있다.
P 개의 도메인 우선 발현 벡터에 클로닝 한 다음 박테리아에서 발현된다. 단백질은 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피를 고정화 것을 포함 세 단계를 사용하여 정제한다. 에서원칙적으로, 명시 클론 정제,이 프로토콜 신흥 노로 바이러스 균주 분석을위한 신속하게 시스템 개 미만 주 단백질을 결정화 할 수있다.
Introduction
인간의 noroviruses는 급성 위장염 전 세계적으로 하나의 주요 원인이다. 이 바이러스는 노로 바이러스, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus 및 Nebovirus 포함 적어도 다섯 장군이가있는의 Caliciviridae 제품군에 속한다. 의료 시스템과 다양한 유통에 높은 영향에도 불구하고, 인간의 noroviruses의 연구는 강력한 세포 배양 시스템의 부족에 의해 방해된다. 현재까지 사용 가능한 승인 된 백신이나 항 바이러스 전략이 없다.
노로 바이러스의 주요 캡시드 단백질, VP1이 되나, 쉘 (S) 영역 및 돌출부 (P)이 영역들로 분할 될 수있다. P 개의 도메인이가요 성 힌지 (H) 영역으로 S 도메인에 접속된다. P 개의 영역은 바이러스 캡시드의 최 외측 부분을 형성하는 반면, S 도메인은 바이러스 RNA의 주위에 지지체를 형성한다. 박테리아에서 발현 될 때 P 도메인은 생물학적으로 중요한 이합체로 어셈블. 는 P d를IMER은 탄수화물 구조와 상호 작용, 타액에 용해 항원으로 존재하는 특정 숙주 세포 3에서 볼 수 있습니다 히스 – 혈액형 항원 (HBGAs를)라고. 는 P 도메인 HBGA의 상호 작용은 감염 4 중요한 것으로 생각된다. 사실, 최근의 보고서는 합성 HBGAs 또는 시험 관내 5 인간의 노로 바이러스 감염 박테리아를 HBGA가 발현의 중요성을 밝혔다.
noroviruses의 숙주 세포 부착에 관한 현재의 연구는 주로 곤충 세포 혹은 대장균 (대장균)에서 발현 된 재조합 P 도메인으로 표현 될 수있는 바이러스 입자 (VLP를)로 수행된다. 원 해상도의 P HBGA 도메인 상호 작용을 이해하기 위해, P-도메인 HBGA 복잡한 구조는 X 선 결정학을 이용하여 해결 될 수있다. 여기서, 우리는 높은 수량과 품질 P 도메인의 생산은 X 선 crystall 용으로 사용될 수 있도록 P 도메인 발현 및 정제를위한 프로토콜을 기술ography. 또한,이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역과 비 구조 단백질에 적용 할 수있다.
P 개의 도메인 E. 대한 코돈 최적화 대장균 발현과 표준 전송 벡터에 클로닝. P 개의 도메인이어서 폴리 히스티딘 (그의) 태그 및 프로테아제 절단 부위 다음된다 만노오스 결합 단백질 (MBP)를 코딩하는 발현 벡터로 재 클로닝된다. MBP-그의-P 도메인 융합 단백질로 표현 E. 대장균은 세 정제 단계 하였다. MBP-그의-P 도메인 융합 단백질은 고정화 된 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피 (IMAC)를 이용하여 정제한다. 다음에, 융합 단백질은 인간 리노 바이러스 (HRV) -3C 프로테아제 및 P 영역이 분리되어로 절단된다 MBP-그의 부가 IMAC 정제 단계에 의해. 마지막으로, P 도메인은 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)를 이용하여 정제한다. 정제 된 P 영역은 X 선 결정학에 사용될 수있다. 단백질 결정화 조건의 스크리닝 PERFO 인다른 P 도메인 단백질 농도를 사용하여 시판의 스크리닝 키트 rmed. 결정 성장이 관찰되고, 가장 유망한 조건이 최적화된다.
방법은 여기에 설명과 함께, 그것은 미만 사주 내에서 구조화 단백질 유전자에서 갈 수 있습니다. 따라서, P 도메인의 발현, 정제, 결정화의 우리의 방법은 분자 수준에서 노로 바이러스 – 호스트 상호 작용을 연구하고 최신 백신 디자인 및 약물 검사를 지원하기 위해 중요한 데이터를 제공하기에 적합하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 높은 품질과 수량에서 노로 바이러스의 P 도메인의 발현 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. Noroviruses 잘 연구되지 않고 구조적 데이터가 지속적으로 필요하다. 우리의 지식에, 다른 프로토콜 (예를 들면, GST 태그가 P 영역)을 이용하여 P 영역 생성은 지금까지 문제가되고 있으며, 노로 바이러스 호스트 상호 작용에 충분한 구조적 데이터가 누락되어있다. 방법은 여기에…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.
Materials
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 cm x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
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