متعدد انزيم الفحص باستخدام عالية الإنتاجية نظام فحص انزيم الوراثية
Summary
This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).
Abstract
The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.
Introduction
والإنتاجية العالية التقنية وحيدة الخلية فحص وضعت مؤخرا تسمح أنزيمات جديدة ليتم فرزهم من مكتبة الوراثية على نطاق واسع على أساس الأنشطة الوظيفية 1. على مستوى خلية واحدة، ويعمل البروتينات التي تنظم النسخ لتحريك التعبير الجيني مراسل بواسطة الاستشعار عن بعد الجزيئات الصغيرة التي تنتج نتيجة لنشاط إنزيم الهدف. تشارك نهج واحد في وقت مبكر من العزلة من الاوبرون الفينول مهينة من رالستونيا eutropha E2 باستخدام التعبير الجيني الناجم عن الركيزة فحص (SIGEX) الأسلوب، الذي الركيزة أن تتجسد في التعبير عن بروتين مراسل 2. وقد استخدم نهار الزائفة الكريهة لتحديد البنزالدهايد نازعة 3، وLysG من الوتدية glutamicum استخدمت لفحص عالية الإنتاجية من سلالة جديدة إنتاج L-يسين من المكتبات متحولة متنوعة (4).
سابقا، وهو screeni انزيم الوراثيةواقترح نظام نانوغرام (GESS) كمنبر الفحص المطبقة عموما 5. يستخدم هذا النظام dimethylphenol منظم-الاعتراف الفينول، دي إم بي آر، من P. الكريهة. دي إم بي آر (E135K)، ومتحولة من دي إم بي آر، ويمكن أيضا أن تستخدم في GESS (PNP-GESS) للكشف عن -nitrophenol ص (PNP). في وجود الانزيمات هدف إنتاج مركبات الفينول، GESS في E. خلايا القولونية تنبعث إشارة مضان، مما يتيح للعزلة السريع من الخلايا واحدة باستخدام فارز مضان تنشيط الخلايا (FACS). ولكن التعبير عن انزيم metagenomic يبدو أضعف من أن الإنزيمات المؤتلف التقليدية؛ وبالتالي، تم تصميم GESS للكشف عن المركبات الفينولية مع أقصى قدر من الحساسية من خلال التحقيق في مزيج من الموقع الريباسي ملزم (RBS) وتسلسل فاصل جنبا إلى جنب مع أفضل حالة التشغيل 5.
واحدة من المزايا الأساسية للGESS غير أن هذا الأسلوب واحد يسمح نظريا فحص اوفإيه من 200 أنواع مختلفة من الانزيمات في قاعدة البيانات بريندا (الجدول 1، HTTP: // www.brenda-enzymes.info، 2013،7) ببساطة عن طريق استخدام ركائز مختلفة. فقد تبين أن السيلولوز، والليباز، وباراثيون الميثيل هيدرولاز (ميلا في الساعة) ويمكن الكشف عن استخدام PNP-GESS مع ركائز المناسبة من ص الزبدات -nitrophenyl، ص -nitrophenyl-cellotrioside، وباراثيون الميثيل، على التوالي 5. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت أن الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب)، التي تعد واحدة من الانزيمات الجديدة التي تم تحديدها باستخدام PNP-GESS، هو أول AP بالحرارة وجدت في metagenomes البحرية تكييفها بارد-6.
هنا، يتم تقديم تفاصيل عملية الفرز مع PNP-GESS الكشف عن أنشطة ثلاثة أنواع مختلفة من الليباز enzymes-، السيلولوز، والفوسفاتيز القلوية-وتحديد الانزيمات مرشح جديدة من مكتبة metagenomic 5،6 بسرعة. وتشمل عمليات تجهيزها metagenome مع PNP-GESS وتعمل على فلوريداآه الخلوي فارز. في حين أن الزيارات التي تم الحصول عليها سوف تحتاج إلى أن يكون متتابعا لمزيد من التحديد ويشمل هذا البروتوكول الإجراء وصولا إلى خطوات التأكيد نشاط انزيم باستخدام التدفق الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
زيادة كفاءة إنتاج البيولوجية الحفازة هو المفتاح لنجاح الحيوية والكيميائية القائمة على الصناعة 9 و metagenome يعتبر واحدا من أفضل مصدر الانزيم الطبيعي. في هذا المعنى، لا بد من فحص أنزيمات جديدة من metagenome حيث لم تستكشف أغلبية الموارد الوراثية 10. وقد وضعت عدة طرق ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-mL conical tube | BD Falcon | ||
| 14-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria- Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L |
| Cell storage media | 2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
Referenzen
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. Novel screening methods-biosensors. Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J. Metagenomics and industrial applications. Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
