Multi-enzyme préalable au moyen d'un système de criblage enzymatique génétique à haut débit
Summary
This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate).
Abstract
The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.
Introduction
Un haut-débit technique de dosage unique cellule récemment développée permet de nouvelles enzymes destinées à être projetées à partir d' une bibliothèque génétique à grande échelle sur la base de leurs activités fonctionnelles 1. Au niveau d'une seule cellule, les protéines régulatrices de la transcription sont utilisées pour déclencher l'expression du gène rapporteur par la détection de petites molécules qui sont produites par suite d'une activité de l'enzyme cible. Une première approche implique l'isolement d'un opéron phénol dégradant de Ralstonia eutropha E2 en utilisant l'expression génique induite par le substrat procédé de criblage (SIGEX), dans lequel le substrat induit l'expression d'une protéine rapporteur 2. Nhar de Pseudomonas putida a été utilisé pour sélectionner benzaldéhyde déshydrogénase 3 et lysG de Corynebacterium glutamicum a été utilisée pour le criblage à haut débit d'une nouvelle souche L-lysine-production de diverses bibliothèques de mutants 4.
Auparavant, une enzyme génétique screenisystème ng (GESS) a été proposé comme une plate – forme de criblage généralement applicable 5. Ce système utilise le régulateur de diméthylphénol phénol-reconnaissant, DmpR, de P. putida. DmpR (E135K), et un mutant de DmpR, peuvent également être utilisés dans GESS (PnP-GESS) pour la détection de p – nitrophénol (PnP). En présence d'enzymes cibles produisant des composés phénoliques, dans SSES E. cellules de E. coli , émet un signal de fluorescence, ce qui permet l'isolement rapide des cellules individuelles en utilisant un trieur de cellules activées par fluorescence (FACS). Mais l'expression de l'enzyme metagénomique semble être plus faible que celle des enzymes recombinantes classiques; Par conséquent, SSES a été conçu pour détecter des composés phénoliques avec un maximum de sensibilité en recherchant la combinaison d' un site de liaison au ribosome (RBS) et les séquences de terminaison ainsi que des conditions de fonctionnement optimales 5.
L'un des avantages fondamentaux de GESS est que cette méthode unique permet théoriquement la projection de over de 200 types différents d'enzymes dans la base de données BRENDA (tableau 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) en utilisant simplement différents substrats. Il a été montré que la cellulase, la lipase, et parathion-méthyl – hydrolase (MSP) peut être détectée à l' aide pnp SSES avec des substrats appropriés de p – nitrophényl butyrate de p – nitrophényle-cellotrioside et le parathion de méthyle, respectivement 5. Récemment, il a été prouvé qu'une phosphatase alcaline (AP), qui est l' une des nouvelles enzymes identifiées à l' aide pnp SSES, est le premier point d' accès trouvée dans thermolabile métagénomes marines adaptées au froid 6.
Ici, les détails du processus de sélection est présenté avec pNP-GESS détecter les activités de trois types de lipase enzymes-, cellulase, et la phosphatase alcaline différentes -et rapidement identifier de nouvelles enzymes candidats à partir d' une bibliothèque métagénomique 5,6. Les procédés comprennent métagénome prétraiter avec pNP-GESS et l'exploitation d'un flow cytométrie trieuse. Bien que les résultats obtenus devront être séquencés pour une identification plus poussée, ce protocole couvre la procédure jusqu'à les étapes de confirmation de l'activité enzymatique par cytométrie en flux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Accroître l' efficacité de biocatalyseurs de production est une clé pour le succès de la bio-chimique à base industrie 9 et métagénome est considéré comme l' un des meilleurs source d'enzyme naturelle. En ce sens, il est essentiel de criblage de nouvelles enzymes du métagénome où la majorité des ressources génétiques n'a pas été explorée 10. Plusieurs méthodes de criblage ont été développés , qui détectent directement des produits enzymatiques utilisant des a…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-mL conical tube | BD Falcon | ||
| 14-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-mL round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria- Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L |
| Cell storage media | 2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
Referenzen
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