VACUSIP eine verbesserte Inex Methode für<em> In Situ</em> Messung von partikulären und gelösten Verbindungen, die durch Active Suspension Feeders Verarbeitet

Summary

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

Abstract

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

Introduction

Benthic Filtrierer spielen eine entscheidende Rolle in der Funktionsweise der marinen Ökosysteme ^1. Durch das Filtern von großen Mengen Wasser ^2,3, sie zu entfernen und Partikel (Plankton und Geröll) und gelösten Verbindungen ¹ (und Referenzen darin) und sind ein wichtiger Agent der Benthos-pelagische Kopplung ^4,5 und Nährstoffkreislauf ^6,7 ausscheiden. Genau das Partikelmess und gelösten Verbindungen entfernt und durch benthische Filtrierer (wie Schwämme, Seescheiden, Polychaeten und bivalves) ausgeschieden ist von grundlegender Bedeutung, ihre Physiologie, Stoffwechsel zu verstehen und Nahrungsökologie. Zusammen mit Geschwindigkeitsmessungen Pumpen, sondern ermöglicht auch eine Quantifizierung der Nährstoffflüsse durch diese Organismen und ihre ökologischen Auswirkungen auf die Wasserqualität sowie auf Ökosystemebene Prozesse vermittelt.

Die Wahl der geeigneten Methode zur Messung der Entfernung und Produktionsraten von partikulären und gelösten comPfund durch Suspension Filtrierer ist entscheidend für die zuverlässige Daten zu erhalten , die ihre Fraßaktivität ^8. Wie durch Riisgård und andere unangemessene Methoden Bias-Ergebnisse darauf hingewiesen, verzerren experimentellen Bedingungen zu falschen Einschätzungen der Einnahme und Ausscheidung bestimmter Stoffe, und von diesen Organismen verarbeitet, um fehlerhafte Quantifizierung der Nährstoffflüsse führen kann.

Die beiden am häufigsten verwendeten Methoden partikulären und gelösten Nährstoffflüsse in Filtrierer beinhalten messen entweder Inkubation (indirekte Techniken) oder simultane Erfassung von Umgebungs- und atmete aus Wasser (direkte Techniken). Die Inkubation Techniken basieren in der Konzentration von partikulären und gelösten Nährstoffen im Wasser inkubiert, die Änderungsrate auf Messen und ⁸ Produktionsraten oder Entfernung im Vergleich zu angemessenen Kontrollen abzuschätzen. Jedoch kann ein Organismus in einer Inkubationskabine umschließt seine feedin änderng und Pumpverhalten aufgrund von Änderungen in der natürlichen Strömungsbereich aufgrund einer Abnahme der Sauerstoff und / oder in der Nahrungsmittelkonzentration oder aufgrund der Ansammlung von Ausscheidungsverbindungen in der Inkubation ^7,9 Wasser (und Referenzen darin). Zusätzlich zu den Auswirkungen der Confinement und modifizierte Wasserversorgung stammt ein großer Vorspannung der Inkubation Techniken aus re Filtrationswirkungen (siehe beispielsweise ^10). Obwohl einige dieser methodischen Probleme haben mit der rechten Form und Volumen des Inkubationsgefäßes ¹¹ oder mit der Einführung einer Umlaufglasglocke System in situ ^12, diese Technik oft unterschätzt Entfernung und Produktionsraten überwunden. Quantifizieren des Metabolismus von gelösten Verbindungen, wie gelösten organischen Stickstoff (DON) und Kohlenstoff (DOC) oder anorganische Nährstoffe, hat sich als besonders zu sein , anfällig für Verzerrungen verursacht durch Inkubation Techniken ^13.

In den späten 60er und frühen 70er Jahre, Henry Reiswig^9,14,15 Vorreiter bei der Anwendung der direkten Techniken zur Partikelentfernung von riesigen Karibik Schwämme durch getrenntes Abtasten des Wasser ein- und ausgeatmeten durch die Organismen in situ, zu quantifizieren. Aufgrund der Schwierigkeit Reiswig der Technik , die auf kleinere Filtrierer und in anspruchsvoller Unterwasserbedingungen, der Großteil der Forschung auf diesem Gebiet an das Labor wurde anzuwenden beschränkt (in vitro) ¹⁶ meist indirekte Inkubationstechniken einsetzt. Yahel und Kollegen wieder montiert Reiswig direkte in situ – Technik in kleinerem Maßstab Bedingungen zu arbeiten. Ihre Methode, genannt ¹⁶ INEX, basiert auf der gleichzeitigen Unterwasserprobenentnahme des Wassers inhaliert (In) und abgeatmet (Ex) durch ungestörte Organismen. Die unterschiedliche Konzentration einer Substanz (zB Bakterien) zwischen einem Paar von Proben (inex) liefert ein Maß für die Retention (oder Produktion) dieses Stoffes durch das Tier. Die INEX Technik verwendet offene Röhren undberuht auf der excurrent Strahl durch die Pumpaktivität des untersuchten Organismus produziert, um das umgebende Wasser in das Sammelrohr passiv ersetzen. Während Yahel und Kollegen diese Technik erfolgreich bei der Untersuchung von mehr als 15 verschiedenen Aussetzung beantragt haben Beschicker Taxa (zB ^17), wobei das Verfahren durch das hohe Maß an Übung und Erfahrung erforderlich, von der winzigen Größe einiger excurrent Öffnungen beschränkt ist, und durch Seegang.

Um diese Hindernisse zu überwinden, entwickelten wir eine alternative Technik basiert auf kontrollierten Absaugung des abgetasteten Wasser durch winzige Röhrchen (Außendurchmesser <1,6 mm). Unser Ziel war es, eine einfache, zuverlässige und kostengünstige Vorrichtung zu schaffen , die in situ Wasserentnahme aus einem ganz bestimmten Punkt, wie die excurrent Öffnung benthischer Filtrierer sauber und kontrolliert erlauben würde. Um wirksam zu sein, hat das Verfahren nicht aufdringlich sein, um nicht die Umgebungsströmungsregime zu beeinflussen oder die b ändernehavior der untersuchten Organismen. Das Gerät präsentiert hier wird VACUSIP bezeichnet. Es ist eine Vereinfachung des SIP – System entwickelt von Yahel et al. (2007) ¹⁸ für ROV-basierte Punktabtastung in der Tiefsee. Die VACUSIP ist wesentlich billiger als die ursprüngliche SIP und es hat für SCUBA-basierte Arbeit angepasst. Das System wurde nach den Prinzipien entworfen präsentiert und getestet von Wright und Stephens (1978) ¹⁹ und Møhlenberg und Riisgård (1978) ²⁰ für Labor – Einstellungen.

Obwohl das VACUSIP System für in – situ – Untersuchungen des Stoffwechsels von benthic Filtrierer entwickelt wurde, kann es auch für Laborstudien verwendet werden , und überall dort , wo eine kontrollierte und saubere, Point-Source – Wasser – Probe erforderlich ist. Das System ist besonders nützlich , wenn die Integration über längere Zeit (min-Stunden) oder in situ Filtrationen erforderlich sind. Die VACUSIP ist seit 2011 erfolgreich am Yahel Labor verwendet, und hat auchwurde in zwei aktuellen Studien von Nährstoffflüsse vermittelt durch Karibik und Mittelmeer Schwammarten ²¹ (Morganti et al. eingereicht) eingesetzt.

Die Verwendung spezieller Sampler, der verlängerten Abtastdauer, und den Feldbedingungen, in denen VACUSIP angelegt wird, ziehen einige Abweichungen von Standardprotokollen ozeanographischer zum Sammeln, Filtern und Proben für empfindliche Analyte zu speichern. Um das Risiko einer Kontamination durch das VACUSIP System oder das Risiko einer Modifikation des beprobten Wasser durch bakterielle Aktivität nach der Entnahme zu verringern, haben wir getestet , verschiedene in situ Filtration und Lagerungsverfahren. Verschiedene Filtervorrichtungen, Sammelgefäße und Speichern Verfahren wurden untersucht , um die am besten geeignete Technik für die Analyse von gelösten anorganischen (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ^+, SiO ₄₎ zu erreichen , und organische (DOC + DON) Verbindungen und ultra Plankton (<1081; m) und partikulärer organischer (POC + PON) Probenahme. Um weiter das Risiko einer Kontamination zu reduzieren, vor allem unter Freilandbedingungen wurde die Anzahl der Handhabungsschritte auf ein Minimum reduziert. Die visuelle Format, in dem das Verfahren dargestellt ist, ausgerichtet Reproduzierbarkeit zu erleichtern und um die Zeit zu reduzieren, die erforderlich, um effizient die Technik anzuwenden.

Systemübersicht

Zur in situ gepumpte Wasser aus der Suspension Abzweige mit exhalant Öffnungen so klein wie 2 mm, die Pumpaktivität jeder Probe Die Probe wird zuerst durch Lösen gefiltert Fluorescein gefärbt Meerwasser neben der inhalant Öffnung (en) sichtbar gemacht und das Beobachten seiner Strömung von der excurrent Öffnung ¹⁶ (siehe auch 2B Abbildung in ^18). Das Wasser ein- und ausgeatmeten durch die Studie Probe (angefallenen und excurrent) werden dann mit der Verwendung eines Paares von kleinen Röhren installiert maßgeschneiderte Manipulator oder auf zwei der "ar gleichzeitig abgetastetms "eines upside-down flexible tragbare Stativ (Abbildung 1 und Ergänzungs Video 1). Das Wasser in der Studie Organismus inhaliert wird durch sorgfältiges Positionieren des proximalen Endes eines Rohres innerhalb oder in der Nähe der inhalant Apertur der Studie Organismus gesammelt. Eine identische Rohr dann innerhalb des excurrent Öffnung positioniert ist. Diese Operation gute Pflege erfordert Kontakt oder Störung des Tieres zu vermeiden, beispielsweise durch Sediment Resuspension. das Abtasten zu beginnen, durchsticht ein Taucher ein Septum in den Auffangbehälter mit einer Injektionsnadel auf die anhänge distale Ende jedes Rohrs, so dass der Außenwasserdruck das abgetastete Wasser in den Behälter durch das Entnahmerohr zu zwingen. das Ansaugen durch die Vakuum zuvor in den Fläschchen und durch die Druckdifferenz zwischen dem externen Wasser und dem evakuierten Probenbehälter geschaffen eingeleitet wird .

Um eine saubere Sammlung von ausgeatmeten Wasser gewährleisten und ein versehentliches Absaugen von Ambi zu vermeidenent Wasser ^16, muss die Wasser Abtastrate bei einer signifikant niedrigeren Rate (<10%) als die excurrent Flussrate gehalten werden. Die Saugleistung wird durch die Länge des Rohres und dessen Innendurchmesser (ID) gesteuert. Der kleine Innendurchmesser sorgt auch für eine vernachlässigbare Totvolumen (<200 & mgr; l pro Meter Leitung). Probenahme über längere Zeiträume (Minuten bis Stunden) ermöglicht es, die inhärente Lückenhaftigkeit der meisten Substanzen von Interesse zu integrieren. Um sicherzustellen , dass die Proben werden in längeren Unterwasserprobenahme Sitzungen sowie für den Transport zum Labor ausreichend konserviert, eine in situ Filtration wird für empfindliche Analyte empfohlen. Die Auswahl der Stichprobenbehälter, Filtersystem und Schläuche werden durch die Studie Organismen und der spezifischen Fragestellung bestimmt. Das Protokoll weiter unten beschrieben wird davon ausgegangen , dass eine vollständige metabolische Profil von Interesse ist (für eine Übersicht siehe Abbildung 2). Jedoch erlaubt die modulare Natur des Protokolls foder einfache Änderung aufzunehmen einfacher oder sogar sehr unterschiedliche Stichprobenpläne. Für eine vollständige metabolische Profil sollte die Probenahmeprotokoll die folgenden Schritte umfassen: (1) Strömungsvisualisierung; (2) Die Probenahme ultra Plankton Fütterung (Plankton <10 & mgr; m); (3) Die Probenahme anorganische Nährstoffe Aufnahme und Ausscheidung (in-line Filter verwendet wird); (4) Die Probenahme gelösten organischen Aufnahme und Ausscheidung (unter Verwendung von in-line-Filter); (5) Particulate Fütterung und Ausscheidung (unter Verwendung von in-line-Filter); (6) Wiederholen Sie Schritt 2 (Ultra-Plankton Fütterung als Qualitätskontrolle); (7) Visualisierung fließen.

Wenn logistisch machbar, wird empfohlen , dass die metabolische Profilmessungen mit Pumprate kombiniert werden (zB Verfahren der Farbstofffront Geschwindigkeit, in ¹⁶⁾ sowie mit der Atmung Messungen. Diese Messungen werden am besten am Anfang und am Ende der Stichprobensitzung genommen. Für die Atmung Messung sind unter Wasser Optodenbasis oder Mikroelektroden bevorzugt.

Protocol

1. Vorbereitende Schritte und Reinigungsverfahren Reinigungslösung Schutzausrüstung tragen, einen Laborkittel und Handschuhe zu allen Zeiten. Führen Sie diese vorbereitenden Schritte in einem sauberen Raum frei von Staub und Rauch. Bereiten Sie eine 5-10% ige Salzsäure (HCl) -Lösung mit frischen, hochwertigen, doppelt destilliertes Wasser. Bereiten Sie eine 5% hochlösliche basische Mischung aus anionische und nichtionische Tensid-Lösung (siehe Materi…

Representative Results

Optimierung von Meerwasser Erhebungsmethoden Die Auswahl der Sammler Fläschchen und Reinigungsverfahren VACUSIP-kompatible Auffanggefäße sollte ein Septum, die Probenahme eingeleitet werden können, indem sie mit einer Spritzennadel Piercing. Sie sollten die erhöhten Unterwasserdruck (2-3 bar bei typischen Taucharbeitst…

Discussion

Vorbereitende Schritte

Collector Fläschchen für DOM und Nährstoffanalysen

Da Kollektor Gefäße können mit gelösten Mikrokomponenten interagieren und die Sampler Wände ^30-34, verschiedene Fläschchen für DOM und Nährstoff Sammlung wurden getestet kann ein Substrat für das Wachstum von Bakterien. Borosilikat ist nicht für die Kieselsäure Quantifizierung empfohlen ^33,35, da Glasflaschen die…

Materials

GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (250µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA VIALS	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09)
HDPE VIALS	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42)
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter,  pore size 0.7µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 2000 Solution	Decon Labs	E123FH	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7mm x 30mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181