Isolement de périvasculaire Multipotentes Précurseurs cellulaires Populations de Cardiac Human Tissue
Summary
du tissu cardiaque humain héberge des populations de cellules précurseurs pluripotentes périvasculaires qui peuvent être appropriés pour la régénération du myocarde. La technique décrite ici permet l'isolement et la purification simultanée de deux populations de cellules stromales pluripotentes associées aux vaisseaux sanguins d' origine, c. -à- CD146 + CD34 – péricytes et les cellules CD34 + CD146 – cellules de l' adventice, du myocarde humain.
Abstract
Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34– pericytes and vascular CD34+CD146– adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.
Introduction
Le cœur a longtemps été considéré comme un organe post-mitotique. Cependant, des études récentes ont démontré la présence du chiffre d'affaires de cardiomyocytes limitée dans les cœurs humains adultes 1. Cellules autochtones souches / progénitrices avec cardiomyocytes potentiel de différenciation ont également été identifiés dans le myocarde chez les rongeurs adultes et les cœurs humains, y compris Sca-1 +, c-kit +, cardiosphere formation et , plus récemment, les cellules précurseurs périvasculaires 2,3. Ces cellules représentent des candidats attrayants pour les thérapies visant à améliorer cardiaque réparation / régénération par la transplantation de cellules ou de stimulation de la prolifération in situ.
Mésenchymateuses souches / cellules stromales (MSC) ont été isolés à partir de presque tous les tissus humains 4,5 essais cliniques des applications thérapeutiques de MSC ont été réalisées pour de multiples états pathologiques tels que la réparation cardiovasculaire 6, la réaction du greffon contre l'hôte maladie 7 </sup>, Et la cirrhose du foie 8. Les effets bénéfiques ont été attribués à la capacité des cellules souches mésenchymateuses à: la maison aux sites d'inflammation 9; différencier en types 10 de cellules différentes; sécréter des molécules pro-réparatrices 11; et moduler des réponses immunitaires 12 hôtes. L'isolement des cellules souches mésenchymateuses a toujours compté sur leur adhésion préférentielle à des substrats en plastique. Cependant, la population de cellules résultante est typiquement sensiblement hétérogène 13. En utilisant cellulaire activé par fluorescence (FACS) avec une combinaison de marqueurs clés de cellules périvasculaires, nous avons été en mesure d'isoler et de purifier un multipotentes population précurseur MSC-like (CD146 + / CD31 – / CD34 – / CD45 – / CD56 -) à partir de de multiples tissus humains , y compris des adultes du muscle squelettique et la graisse blanche 14.
populations de cellules périvasculaires dans divers tissus non cardiaques se sont avérés avoir des propriétés souches / cellules progénitrices ae sont à l'étude pour une utilisation clinique dans le cadre cardiovasculaire. Péricytes, l' un des sous – ensembles les cellules périvasculaires les plus connus, sont une population hétérogène qui jouent plusieurs rôles physiopathologiques , y compris dans le développement de nouveaux vaisseaux 15, la régulation de la pression artérielle 16, et le maintien de l' intégrité vasculaire 17,18. Comme indiqué dans plusieurs tissus, des sous – ensembles spécifiques de péricytes expriment nativement des antigènes de MSC et de soutenir leurs phénotypes MSC comme dans la culture primaire après FACS purification 14. De plus, ces cellules maintiennent de manière stable leurs phénotypes à long terme au sein de la culture et présentent un potentiel de différenciation multi-lignée, semblable à MSCs 19,20. Ces résultats suggèrent que les péricytes sont une des origines du MSC insaisissable 14. Le potentiel thérapeutique des péricytes a été démontrée par une réduction de la cicatrisation du myocarde et l'amélioration de la fonction cardiaque après une transplantation dans lésé par une ischémiecoeurs 21. Récemment, nous avons purifié avec succès pericytes du myocarde humain et démontré leurs phénotypes MSC-like et multipotence (adipogenèse, chondrogenèse et ostéogenèse) avec l'absence de myogenèse squelettique 3. En outre, les péricytes myocardiques exposées différentielles capacités potentielles et angiogéniques cardiomyogéniques en comparaison avec leurs homologues purifiés à partir d'autres organes.
Une deuxième population de cellules souches / progénitrices multipotentes périvasculaires, la cellule adventice, a été isolé à partir de veines saphènes humaines sur la base de l' expression de CD34 positif 22. Les cellules de l' adventice veineuses ont été montrés comme ayant un potentiel clonogénique, la capacité de différenciation mésodermique et le potentiel pro – angiogénique in vitro. La transplantation de ces cellules dans les cœurs lésés par une ischémie des souris a entraîné une réduction de la fibrose interstitielle, une augmentation de l'angiogénèse et du flux sanguin myocardique, une réduction ventriculaire diltion, et l' éjection cardiaque augmenté la fraction 23. Fait intéressant, les cellules de l' adventice adipeux a été démontré que l' expression de perdre le CD34 et le CD146 upregulate expression dans la culture en réponse au traitement angiopoïétine II, ce qui suggère l'adoption d'un phénotype de péricytes avec une stimulation 24. À l'intérieur du coeur, cependant, la population de cellules de l'adventice n'a pas encore été purifiées par FACS de manière prospective et / ou bien caractérisée. En utilisant les procédures d'isolement cellulaire décrits dans les sections suivantes, nous sommes actuellement caractérisons cellules adventice du myocarde et d'enquêter sur leur potentiel pour les applications régénératives.
Nous décrivons ici un procédé pour isoler et purifier les deux sous-populations de cellules souches / progénitrices du myocarde périvasculaire adultes ou fœtaux humains. Cette méthode d'isolement cellulaire prospective permettra aux chercheurs d'obtenir des sous-ensembles de cellules souches / progénitrices périvasculaires isogéniques à partir de biopsies cardiaques humaines pour des études comparatives et further explorer leur potentiel thérapeutique dans divers états pathologiques cardiaques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des preuves croissantes supporte une capacité de régénération limitée du cœur humain adulte après une blessure. Identification et caractérisation des cellules précurseurs natifs responsables de ces réactions de régénération dans les cœurs blessés sont essentiels tant pour la compréhension des mécanismes et voies de signalisation associées et le développement d'approches à utiliser ces cellules thérapeutiquement.
Protocoles précédents ont décrit l'isolement des…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi and Will Ramsay at the University of Edinburgh and Alison Logar and Megan Blanchard at the University of Pittsburgh for their expert assistance with flow cytometry. We also wish to thank Anne Saunderson and Lindsay Mock for their help with obtaining human tissues. Human adult and fetal heart tissue samples were procured with full ethics permission of the NHS Scotland Tayside Committee on Medical Research Ethics and the NHS Lothian Research Ethics Committee (REC08/S1101/1) respectively. This work was supported by grants from the Medical Research Council (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children’s Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP), and the Henry J. Mankin Endowed Chair at University of Pittsburgh (JH). JEB was supported by a British Heart Foundation Centre of Research Excellence doctoral training award (RE/08/001/23904). WC was supported in part by an American Heart Association predoctoral fellowship (11PRE7490001).
Materials
| AbC Anti-mouse Bead Kit | Molecular Probes | A-10344 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Reconstitute powder as required and filter sterilise |
| Collagenase II | Gibco | 17101-015 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| anti-human CD34-PE | BD Pharmingen | 555822 | Keep sterile |
| anti-human CD45-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| anti-human CD146-AF647 | AbD Serotec | MCA2141A647 | Keep sterile |
| EGM2-BulletKit | Lonza | CC-3162 | For collection of cells and culture until adhered |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | ThermoFischer Scientific | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFischer Scientific | 10500-064 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Dilute with sterile water |
| IgG1k-PE | BD Pharmingen | 559320 | Keep sterile |
| IgG1k-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557873 | Keep sterile |
| IgG1k-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557872 | Keep sterile |
| IgG1k-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| IgG1k-647 | AbD Serotec | MCA1209A647 | Keep sterile |
| Mouse serum | Sigma Aldrich | M5905 | Keep sterile |
| Paraffin Film – Parafilm M | Sigma Aldrich | P7793 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15979-063 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 | ThermoFischer Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max | Sigma Aldrich | R7757 | Keep sterile |
| Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| FACSARIA FUSION | BD Pharmingen | Fluorescence Activated Cell Sorter |
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