Concurrerende Transplantaties om hematopoietische stamcellen Fitness Evalueer
Summary
This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.
Abstract
The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.
Introduction
Hematopoiese is een regeneratief proces dat het aanvullen van bloedcellen die zijn verloren door letsel, straling en celdood verzekert. Dit proces verzekert hematopoietische stamcellen (HSC) die grotendeels in de volwassen beenmerg bevinden. Bovendien kunnen hematopoëtische stamcellen worden gebruikt voor therapeutische doeleinden in auto-immuunziekten, hematologische maligniteiten en immuundeficiënties 1. Er is dus behoefte aan een beter begrip van de mechanismen die HSC functie te reguleren, met inbegrip van hun proliferatieve expansie en hun vermogen om te bereiken en engraft de ontvanger beenmerg na de transplantatie. Hoewel recente studies verschillende celoppervlak markers, zoals de SLAM familieleden CD150 en CD48, prospectief verrijken HSCs volwassen en foetale HSCs ongeveer 50% zuiver 2-4 gemeld, de gouden standaard maat voor functionele HSCs blijft in vivo repopulatie assay bepalen hun vermogen om te herstellen bloed cell productie in een bestraald gastheer 5.
De in vivo klonale opnieuw bevolken test werd oorspronkelijk ontwikkeld door Till McCulloch en 6 en is sindsdien verfijnd en uitgebreid. Zoals oorspronkelijk gedefinieerd, HSC zorgen voor levenslang productie bloedcellen door middel van zelf-vernieuwing en differentiatie. De overdracht van HSC in een bestraalde ontvanger laat ons dus beoordelen: hun vermogen om te differentiëren door de analyse van de verschillende bloedcellijnen (T lymfocyten, B lymfocyten, granulocyten, monocyten) en hun vermogen tot zelfvernieuwing via seriële transplantatie. De test zou meestal om de vergelijking van de functionaliteit en / of de hoeveelheid van twee populaties van HSCs, bijvoorbeeld cellen uit twee muizen van verschillende genotypen of cellen die zijn behandeld of onbehandeld met verschillende factoren die de handhaving of uitbreiding van HSCs invloed kunnen hebben in de cultuur. Donor chimerisme, of de bijdrage van de overgedragen donor HSC to bloedcellen kan dan worden bepaald met stroomcytometrie analyse in het perifere bloed en beenmerg middels celoppervlaktemerkers of andere methoden die donor cellen onderscheiden van de ontvanger of gastheer. De meest gebruikte markers zijn zeker de twee allelen van het gen Ptprc of CD45 leukocyt antigen 7 die is gekozen voor de onderstaande voorbeelden.
De klonale herbevolking test kan zowel competitief of niet-competitief zijn. In een niet-competitieve omgeving, zijn de controle en test HSC overgebracht in afzonderlijke ontvangende muizen en de resultaten voor elk celtype wordt onafhankelijk van de andere. In een competitieve omgeving, is de functie van zowel test- en controle HSCs afgemeten inwoners concurrent HSCs. De hier beschreven protocol gebruikt de competitieve omgeving maar kan ook worden aangepast voor niet-competitieve situaties. Beide benaderingen hebben hun voordelen en beperkingen, en we zullen ze te vergelijken in detail in dediscussie. We beschrijven ook verschillende benaderingen van het eigen vermogen van het aantal getransplanteerde HSC te garanderen, wordt uitgelegd hoe u de test voor de kwantificering van HSC aan te passen door beperkende verdunning assay (LDA), en geeft voorbeelden van zowel de geslaagde en mislukte transplantaties voor de interpretatie van de resultaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven protocol is bedoeld om de relatieve geschiktheid van de donor (test) HSCs tegen bekende concurrent HSCs evalueren. De situatie van concurrentie verhoogt de relatieve gevoeligheid van de assay (eerder bescheiden afname van stamcellen fitness detecteren) en geeft een interne gekeurd voor de effectiviteit van bestraling en injectie. Er moet echter niet als een absolute maat voor HSC geschiktheid; een daling van de concurrerende reconstructie betekent niet automatisch dat de HSC niet goed zou presteren in…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor Roxann Hétu-Arbour voor hulp met de figuur ontwerp en de demonstratie van de procedures. Onderzoek in het lab werd ondersteund door een overgang onderscheiding van de Cole Foundation, Discovery verlenen geen. 419226-2012 van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC) en de Canadese Stichting voor Innovatie (CFI Leaders Fund verlenen nr. 31377). KMH is een Chercheur-Boursier Junior voor het Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS).
Materials
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | ||
| 20G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | ||
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 2.50 | 553142 | Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 0.25 | 25-0031 | For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 0.25 | 12-0193 | |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 0.25 | 47-5931 | |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 2.50 | 11-0453 | |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 1.00 | 48-0454 | |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 1.25 | 13-0452 | |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 1.25 | 13-0031 | |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 1.25 | 13-0112 | |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 1.25 | 13-5931 | |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 0.63 | 13-5921 | |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 0.50 | 561419 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 0.25 | 553355 | |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 0.25 | 558162 | |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 0.50 | 46-1351 | |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 0.63 | 115918 | BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1ml tuberculin syringe with 27G needle | BD Syringe | 309623 | ||
| 1ml tuberculin syringe with 25G needle | BD Syringe | 309626 | ||
| 70 um cell strainer | BD Falcon | 352350 |
Referenzen
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- . Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
