Competitive Transplantationen Blutstammzell-Fitness zur Bewertung
Summary
This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.
Abstract
The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.
Introduction
Hämatopoese ist ein regenerativer Prozess, der das Auffüllen von Blutzellen gewährleistet, dass durch Verletzungen, Strahlung und Zelltod verloren. Dieser Prozess wird von hämatopoetischen Stammzellen (HSC) gewährleistet, die im erwachsenen Knochenmark weitgehend befinden. Zusätzlich können hämatopoetische Stammzellen für therapeutische Zwecke in Autoimmunerkrankungen, hämatologischen Malignitäten und Immundefizienz 1 verwendet werden. Es besteht somit ein Bedarf nach besser, die Mechanismen zu verstehen, die HSC-Funktion regulieren, einschließlich ihrer proliferative Expansion und ihre Fähigkeit, den Empfängerknochenmark nach der Transplantation zu erreichen und engraft. Obwohl neuere Studien mehrere Zelloberflächenmarker berichtet haben, einschließlich der SLAM Familienmitglieder CD150 und CD48, prospektiv erwachsenen HSZ und fetale HSZ auf ca. 50% Reinheit 2-4, der Goldstandard Maß für die funktionelle HSZ bleibt ein in vivo repopulating Test bereichern bestimmen ihre Fähigkeit, den Blut c wieder herzustellenell Produktion in einem bestrahlten Host 5.
Die in vivo klonalen repopulating Test wurde zunächst von Till und McCulloch 6 entwickelt und verfeinert und erweitert seitdem. Wie ursprünglich definiert, sorgen HSZ lebenslangen Blutkörperchen durch Selbsterneuerung und Differenzierung. Die Übertragung von HSCs in eine bestrahlte Empfänger ermöglicht uns so beurteilen zu: ihre Fähigkeit, durch die Analyse der verschiedenen Blutzelllinien (T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten) und ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung durch serielle Transplantation zu differenzieren. Der Assay würde beinhalten in der Regel den Vergleich der Funktionalität und / oder der Menge der zwei Populationen von HSCs, beispielsweise Zellen von zwei Mäusen verschiedener Genotypen oder Zellen kommen , die mit verschiedenen Faktoren behandelt oder unbehandelt sind, die die Wartung oder Expansion von HSCs beeinflussen könnten in Kultur. Spenderchimerismus oder der Beitrag der übertragenen Spender HSZ to Blutzellproduktion kann dann mittels Durchflusszytometrie Analyse im peripheren Blut und Knochenmark unter Verwendung von Zelloberflächenmarker oder andere Verfahren bestimmt werden, die Spenderzellen des Empfängers wird zu unterscheiden, oder Host. Die am häufigsten verwendeten Marker sind sicherlich die beiden Allele des Gens oder Protein-Tyrosinphosphatase CD45 Leukozyten – Antigen 7 , die wir für die Beispiele unten angegeben gewählt.
Die klonalen Neubesiedlung Test kann entweder kompetitiv oder nicht-kompetitiv sein. In einer nicht-kompetitiven Einstellung, Kontrolle und Prüfung HSCs werden in getrennte Empfängermäuse übertragen und das Ergebnis für jeden Zelltyp wird von der anderen unabhängig sein. In einem kompetitiven Einstellung wird die Funktion sowohl Test- und Kontroll HSCs gegen eine Population von Kompetitor HSCs gemessen. Das hier beschriebene Protokoll verwendet die Wettbewerbs Einstellung kann aber auch für nicht-kompetitiven Situationen angepasst werden. Beide Ansätze haben ihre Vor- und Nachteile, und wir werden sie im Detail in der VergleichsDiskussion. Wir beschreiben auch verschiedene Ansätze Eigenkapital in der Zahl der transplantierten HSZ, um sicherzustellen, erklären, wie der Test für die Quantifizierung von HSZ anzupassen, indem Verdünnungsanalyse Begrenzung (LDA), und beide Beispiele für die Interpretation der Ergebnisse erfolgreichen und nicht erfolgreichen Transplantationen zur Verfügung stellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um die relative Eignung der Spender (Test) HSZ gegen bekannte Wettbewerber HSZ zu bewerten. Die Konkurrenzsituation erhöht die relative Empfindlichkeit des Assays (eher moderate Abnahme der Stammzell Fitness zu erkennen), und stellt eine interne technischen Kontrolle für die Wirksamkeit der Bestrahlung und Injektion. Es sollte jedoch nicht als absolutes Maß für HSC Fitness verwendet werden; nicht gut in der Abwesenheit von Konkurrenz eine Abnahme der Wettbewerbs Reko…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, dass Roxann Hétu-Arbour für die Unterstützung bei der Abbildung Design und Demonstration der Verfahren. Die Forschung im Labor durch eine Transition Award von der Cole-Stiftung unterstützt wurde, gewähren Discovery-Nr. 419226-2012 aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (NSERC) und der Canada Foundation for Innovation (CFI Leaders Fund nicht gewähren. 31377). KMH ist ein Chercheur-Boursier Junior für den Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS).
Materials
| Microtainer tubes with K2EDTA | BD Biosciences | 365974 | ||
| 20G needle | BD Syringe | For blood sampling from the mandibular vein | ||
| LabQuake Shaker rotisserie | Thermo Scientific | C415110 | Any other rotating mixer will work as well to prevent coagulation of blood samples | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block) | BD Biosciences | 2.50 | 553142 | Alternatively use clone 93 from eBioscience (cat # 14-0161) or Biolegend (cat# 101310) |
| Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 0.25 | 25-0031 | For most flow cytometry antibodies, the clone is important but the colours and companies can vary depending on the available equipment |
| PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3) | eBioscience | 0.25 | 12-0193 | |
| APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 0.25 | 47-5931 | |
| FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20) | eBioscience | 2.50 | 11-0453 | |
| eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104) | eBioscience | 1.00 | 48-0454 | |
| Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2) | eBioscience | 1.25 | 13-0452 | |
| Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11) | eBioscience | 1.25 | 13-0031 | |
| Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 1.25 | 13-0112 | |
| Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5) | eBioscience | 1.25 | 13-5931 | |
| Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119) | eBioscience | 0.63 | 13-5921 | |
| V500 streptavidin | BD Biosciences | 0.50 | 561419 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8) | BD Biosciences | 0.25 | 553355 | |
| PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7) | BD Biosciences | 0.25 | 558162 | |
| PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10) | eBioscience | 0.50 | 46-1351 | |
| Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2) | Biolegend | 0.63 | 115918 | BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone |
| 1ml tuberculin syringe with 27G needle | BD Syringe | 309623 | ||
| 1ml tuberculin syringe with 25G needle | BD Syringe | 309626 | ||
| 70 um cell strainer | BD Falcon | 352350 |
Referenzen
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors. Blood. 108 (2), 737-744 (2006).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Rossi, L., et al. Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice. Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).
- Till, J. E., McCulloch, E. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res. 14, 213-222 (1961).
- Shen, F. W., et al. Cloning of Ly-5 cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).
- . Identification of GM mice. Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).
- Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective. Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).
- Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal. J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).
- Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway. PLoS One. 6 (4), e19279 (2011).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Santaguida, M., et al. JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal. Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).
- Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches. Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).
- Zhang, C. C., Lodish, H. F. Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion. Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).
- Benveniste, P., et al. Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential. Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).
- Fazekasde St Groth, B. The evaluation of limiting dilution assays. J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).
- Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling. Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).
- Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).
- Benz, C., et al. Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs. Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
