Packaging proteine ​​diretto all'interno della membrana esterna vescicole da<em> Escherichia coli</em>: Progettazione, produzione e purificazione

Summary

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Abstract

Un crescente interesse per l'applicazione di tecniche di biologia sintetica per programmare vescicole membrana esterna (OMV) stanno portando ad alcune applicazioni molto interessanti e uniche per OMV in cui le nanoparticelle tradizionali si stanno rivelando troppo difficili da sintetizzare. Ad oggi, tutti i batteri Gram-negativi hanno dimostrato di produrre OMV confezionamento dimostrazione di una varietà di carico che comprende piccole molecole, peptidi, proteine ​​e materiale genetico. Sulla base della loro diversa carico, OMV sono implicati in molti processi biologici che vanno dalla comunicazione cellulare per il trasferimento genico e consegna dei fattori di virulenza seconda di quale batteri producono l'OMV. Solo di recente sono batterica OMV diventati accessibili per l'uso in una vasta gamma di applicazioni attraverso lo sviluppo di tecniche per il controllo e il confezionamento diretta di proteine ​​ricombinanti in OMV. Questo protocollo descrive un metodo per la produzione, purificazione, e l'uso di enzima confezionato OMV prevede migliorata overala produzione ll di enzima ricombinante, aumento vescicole, e una maggiore stabilità dell'enzima. utilizzazione di successo di questo protocollo comporta la creazione di un ceppo batterico che produce contemporaneamente una proteina ricombinante e la dirige per OMV incapsulamento attraverso la creazione di un collegamento sintetica tra la proteina ricombinante e una proteina della membrana esterna di ancoraggio. Questo protocollo dettagli anche i metodi per isolare OMV da colture batteriche così come le tecniche di manipolazione e cose da considerare quando si adattare questo protocollo per l'uso per altre applicazioni uniche quali: la consegna della droga farmaceutica, diagnostica medica e risanamento ambientale.

Introduction

Qui presentata è un metodo per la progettazione, produzione e purificazione di vescicole enzimi batterici caricato membrana esterna (OMV). OMV sono piccole, soprattutto unilamellare, proteoliposomi che variano nel formato 30-200 nm ^1,2. Tutti i batteri Gram-negativi e Gram-positivi che sono stati studiati fino ad oggi hanno dimostrato rilascio di una OMV o vescicole extracellulari (EV) dalla loro superficie ^3,4. Il meccanismo preciso con cui sono prodotti OMV devono ancora essere completamente chiarito causa delle diverse popolazioni batteriche che loro così come le funzioni diverse che servono secernono. OMV hanno dimostrato di trasportare una vasta gamma di carico da piccole molecole, peptidi e proteine di materiale genetico serve una varietà di segnalazione complesso, gene traslocazione, e virulenza FUNZIONI ^5,6.

I meccanismi esatti di OMV biogenesi non sono ben caratterizzati, e sembrano differire tra le specie batteriche. nonostante this Infatti, abbiamo sviluppato un metodo per migliorare l'efficienza di confezionamento di una proteina ricombinante in OMV creando un legame sintetico tra una proteina di interesse e altamente abbondante endogena proteina alla membrana esterna batterica e successiva OMV. In assenza di un legame sintetico, o di affinità artificialmente incorporato, tra la proteina ricombinante espressa e la OMV l'efficienza confezione osservato è molto basso ^7. Questo risultato è prevedibile come l'incorporazione delle proteine ​​all'interno della OMV sia avviene attraverso l'incapsulamento casualità nel momento preciso della formazione OMV in superficie batterica o attraverso il packaging diretto da meccanismi che non sono ben compresi. Qualche successo è stato osservato nel confezionamento proteine ​​semplicemente attraverso sovraespressione nello spazio periplasmatico che si basa su incapsulamento casualità ma efficace imballaggio è altamente proteina dipendente con alcune proteine ​​Confezioni ad alta efficienza rispetto ad altri tha non comprimere affatto ^8-10. Utilizzando le tecniche comuni di biologia sintetica abbiamo cercato di progettare Escherichia coli (E. coli) per produrre contemporaneamente, pacchetto e secernere un enzima attivo di interesse in OMV che aggira le limitazioni attuali conoscenze su come si formano e come OMV carico viene selezionato dai batteri per confezionamento.

Ai fini della presente domanda, un sistema di proteine ​​bioconjugation scaglionato è stato selezionato come il legame sintetici di scelta per facilitare confezionamento direzionale nel OMV. Come suggerisce il nome un sistema proteico bioconjugation scissione comprende due domini subunità complementari che interagiscono tra loro. I domini di proteine spaccatura selezionati ai fini del presente protocollo sono indicati come la SpyCatcher (SC) e SpyTag dominio (ST) e sono derivati dal Streptococcus pyogenes fibronectina-binding protein (FbaB) ^11. Questo sistema proteina spaccatura è insolito in quanto wgallina le due subunità sono all'interno di prossimità un legame isopeptide forma spontaneamente tra la prossimale aspartico residui acidi acidi e lisina aminoacidi che creano un legame covalente. Formazione del legame Isopeptide non richiede l'aggiunta di proteine chaperone, enzimi catalitici o cofattori e può verificarsi facilmente a temperatura ambiente (RT) e su un ampio intervallo di condizioni fisiologicamente rilevanti ^12.

Come prova di concetto, phosphotriesterase (PTE) (CE 3.1.8.1) dal Brevundimonas minuto è stato scelto per essere confezionato in E. coli derivati OMV ^13. PTE contiene un sito attivo binuclear Zn / Zn e ha la capacità di abbattere organofosfati attraverso una reazione di idrolisi conversione aryldialkylphosphates in dialkylphosphates e alcoli arilici ^14. L'esposizione a organofosfati compromette il corretto funzionamento dei neurotrasmettitori attraverso inibendo l'idrolisi di acetilcolina da acetilcolinesterasi alle giunzioni neuromuscolari makincomposti derivati g organofosfati estremamente pericolose ^15. Prolungata o significativa esposizione a organofosfati si traduce spesso in preda a convulsioni incontrollabili e di solito provoca la morte tramite asfissia. Mentre PTE presenta la più alta attività catalitica verso paraoxon, un insetticida molto potente, è anche in grado di idrolizzare una vasta gamma di altri pesticidi e V / tipo G agenti nervini chimici ^16. Per facilitare confezionamento OMV, un plasmide batterico creata che codifica un costrutto genico che contiene un promotore inducibile, una sequenza di localizzazione periplasmatica, ea breve polylinker monte della sequenza SC gene. Inserimento del gene PTE tra il leader e la sequenza SC permette la creazione di un interruttore genetico che colpisce la proteina di fusione PTE-SC allo spazio periplasmatico per imballaggi OMV. Mentre gli sforzi descritti qui concentrano sulla PTE, il gene dell'enzima è intercambiabile e può essere facilmente sostituita con un'altra sequenza genica a FACconfezionamento ilitate di un enzima alternativo o proteine.

Come la seconda parte del collegamento sintetico, viene scelto per presentare la sequenza peptidica ST un'abbondante proteina della membrana esterna (OmpA). Mentre la scelta di proteine ​​di ancoraggio può variare, è essenziale che la proteina ha un dominio permissiva che presenta all'interno dello spazio periplasmatico, tollera il costrutto di fusione senza indurre citotossicità, è noto per essere presente in OMV, e non aggrega quando è ricombinante prodotta. OmpA è un kDa proteina transmembrana 37,2 porin che è noto per essere altamente espresso nella membrana esterna batterica e conseguente OMV ^17. Si è implicato nel trasporto di piccole molecole, <2 nm in termini di dimensioni, attraverso la membrana batterica ^18. Native OmpA ha due domini strutturalmente unici, un barile motivo transmembrana beta e una porzione C-terminale periplasmically solubile noto per interagire con il peptidoglicano ^19. Nel mutante OmpA-ST fusione designed qui la porzione C-terminale della OmpA stato eliminato e la ST è stata fusa alla periplasmically fronte N- o C-Termini. Eliminare la parte periplasmic del OmpA diminuisce il numero di interazioni tra la membrana esterna e il peptidoglicano con conseguente destabilizzazione della membrana che porta a iper-vescicole ^7. Genomic OmpA stata mantenuta in aggiunta al costrutto OmpA-ST ricombinante espressa per mitigare destabilizzazione membrana lordo.

Protocol

1. Preparazione di plasmidi Preparare un plasmide (ad esempio, pET22) contenente la proteina di ancoraggio (OmpA) fusa a un dominio di legame biortogonale (di cui al presente protocollo come anchor-ST), tag epitopo (come 6xHis, myc o la bandiera tag per la purificazione e identificazione), tag periplasmic localizzazione, la resistenza agli antibiotici, e l'origine appropriata di replica in base al ceppo batterico selezionato 7. Estrarre il DNA plasmide da culture durante la no…

Representative Results

L'espressione simultanea di due proteine ​​ricombinanti, come è richiesto per la strategia di imballaggio OMV descritto in questo protocollo, può essere realizzato attraverso diverse vie. Qui, un sistema a due vettoriale è stato utilizzato con origini compatibili di replicazione e cassette geniche inducibili separati. Per l'espressione del PTE-SC costruire un backbone plasmide commerciale (pACY184) è stato progettato per includere una arabinosio inducibile cassetta genica…

Discussion

Questo funzioni di protocollo per dimostrare un rappresentante dirette tecnica imballaggio in cui viene prodotto e confezionato in OMV da E. coli un enzima di interesse. Come per molte tecniche complesse ci sono più aree in cui il protocollo può essere modificato per ospitare per l'utilizzo in diverse applicazioni uniche, alcune delle quali sono descritte di seguito. Mentre il meccanismo di imballaggi OMV e l'enzima incapsulamento può essere adattata alle esigenze specifiche ci sono diversi passaggi …

Materials

IPTG	Any		Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose	Any		Can be prepared ahead of time and stored at 4C.
Ampicillin	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
Chloramphenicol	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
TB/LB Culture Media	Any		Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100	Any		One of many potential suitable surfactants.
Baffled culture flasks	Any		The baffles promote higher levels of aeration.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.
Syringe Filter 0.45 µm	Thermo Scientific	60183-221       (30 mm)	Filter diameter will depend on volume of sample.  Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator	New Brunswick	Excella E24	Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.
Sorvall Culture Centrifuge	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific	WX Ultra 90	Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor	Thermo Scientific	AH-629	Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes        (25 x 89 mm)	Beckman Coulter	344058	Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer	Tecan	Infinite M1000	Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS / particle tracking	NanoSight	LM10	Necessary for OMV size distribution and concentration determination.
BL21(DE3)	NEB		Suitable bacterial expression strain.
pET22	EMD Millipore	69744-3	Other plasmids can be used in place of these.
pACYC184	NEB		Other plasmids can be used in place of these.
Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Example kit.