Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas<em> Escherichia coli</em>: Concepção, produção e purificação

Summary

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Abstract

Um crescente interesse na aplicação de técnicas de biologia sintética para programar vesículas de membrana externa (OMV) estão levando a algumas aplicações muito interessantes e originais para OMV, onde nanopartículas tradicionais estão provando muito difícil de sintetizar. Até à data, todas as bactérias Gram-negativas têm sido mostrados para produzir embalagens OMV demonstrando um de uma variedade de carga que inclui pequenas moléculas, péptidos, proteínas e material genético. Com base na sua carga diversa, OMV estão implicadas em muitos processos biológicos que vão desde a comunicação célula-célula para a transferência de genes e entrega de factores de virulência, dependendo de quais as bactérias são a produção de OMV. Só recentemente é que OMV bacteriana se tornar acessível para uso em uma ampla gama de aplicações através do desenvolvimento de técnicas para controlar e embalagem direta de proteínas recombinantes em OMV. Este protocolo descreve um método para a produção, purificação, e da utilização de enzima embalados OMV para proporcionar melhorada Overaprodução ll da enzima recombinante, o aumento da vesiculação e estabilidade da enzima melhorada. a utilização bem sucedida deste protocolo irá resultar na criação de uma estirpe bacteriana que produz simultaneamente uma proteína recombinante e dirige-o para o encapsulamento OMV através da criação de uma ligação sintética entre a proteína recombinante e uma proteína de âncora de membrana externa. Este protocolo também detalha métodos para isolar OMV a partir de culturas de bactérias, bem como técnicas de manejo adequadas e coisas a considerar quando se adaptando este protocolo a ser utilizado para outras aplicações únicas, tais como: entrega farmacêutica de medicamentos, diagnósticos médicos, e remediação ambiental.

Introduction

Apresentado aqui é um método para a concepção, produção e purificação de vesículas carregadas por enzimas bacterianas da membrana externa (OMV). OMV são pequenos, principalmente unilamelar, proteolipossomas que variam em tamanho de 30-200 nm, ^{de 1,2.} Todas as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas que foram estudados até à data demonstraram libertação de qualquer das OMV ou vesículas extracelular (EV) de sua superfície de ^3,4. O mecanismo preciso pelo qual OMV são produzidos ainda não foram completamente elucidados, devido às diversas populações bacterianas que eles, bem como as diferentes funções que eles servem secretam. OMV foram mostrados para o transporte de uma ampla gama de cargas de pequenas moléculas, péptidos, proteínas e material genético para servir uma variedade de sinalização complexas, a translocação do gene, e virulência funciona ^5,6.

Os mecanismos exactos de OMV biogénese não estão bem caracterizados, e parecem diferir entre as espécies bacterianas. apesar this verdade, temos desenvolvido um método para melhorar a eficiência de embalagem de uma proteína recombinante em OMV através da criação de uma ligação sintética entre uma proteína de interesse e uma proteína endógena altamente abundantes na membrana externa bacteriana e subsequente OMV. Na ausência de uma ligação sintética, ou incorporados artificialmente afinidade, entre a proteína expressa de forma recombinante e a OMV a eficiência de embalagem observada é muito baixo ^7. Este resultado é de se esperar que a incorporação das proteínas dentro da OMV quer ocorre por meio de encapsulamento acaso no preciso momento da formação de OMV na superfície bacteriana ou através de uma embalagem dirigido por mecanismos que não são bem compreendidos. Algum sucesso foi observado em proteínas de embalagem simplesmente através da sobre-expressão dentro do espaço periplásmico que depende de encapsulamento acaso mas eficaz embalagem é altamente dependente da proteína com algumas proteínas de embalagens, a eficiência elevada comparado com outras tha não embalar em tudo ^8-10. Através da utilização de técnicas de biologia sintética comuns procuramos projetar Escherichia coli (E. coli) para produzir simultaneamente, pacote e secretar uma enzima ativa de interesse em OMV que contorna as limitações do conhecimento atual sobre como OMV são formados e como a carga é selecionada pelas bactérias para embalagem.

Para os fins deste pedido de um sistema de divisão de bioconjugação proteína foi escolhida como a ligação sintética de escolha para facilitar a embalagem direccional no OMV. Tal como o nome sugere um sistema de bioconjugação proteína de separação é constituída por duas subunidades domínios complementares que interagem um com o outro. Os domínios proteicos separação seleccionadas para efeitos deste protocolo são referidos como o SpyCatcher (SC) e SpyTag domínio (ST) e são derivados da proteína de ligação pyogenes Streptococcus fibronectina (FbaB) ^11. Este sistema de proteína de divisão é incomum em que wuando as duas subunidades estão dentro da proximidade de uma ligação isopéptido forma espontaneamente entre as extremidades proximal resíduos de ácido aspártico e de ácido amino de lisina, criando uma ligação covalente. Formação da ligação isopéptido não requer a adição de proteínas chaperonas, enzimas, catalisadores ou cofactores e pode facilmente ocorrer à temperatura ambiente (TA) e sobre uma ampla gama de condições f isiologicamente relevantes ^12.

Como prova do conceito, phosphotriesterase (TEP) (EC 3.1.8.1) a partir de Brevundimonas diminuta foi seleccionado para ser embalado em E. coli derivada OMV ^13. TEP contém um Zn / Zn local activo binuclear e tem a capacidade de quebrar organofosfatos através de uma reacção de hidrólise convertendo aryldialkylphosphates em dialkylphosphates e álcoois arilo ^14. A exposição a organofosforados prejudica a função neurotransmissor adequada através da inibição da hidrólise da acetilcolina pela acetilcolinesterase nas junções neuromusculares Makincompostos derivados g organofosforados extremamente perigosas ^15. A exposição prolongada ou significativa para organofosforados geralmente resulta em convulsões incontroláveis e, normalmente, causa a morte por meio de asfixia. Enquanto TEP apresenta a maior actividade catalítica em relação paraoxon, um insecticida muito potente, ele também é capaz de hidrolisar uma variedade de outros pesticidas e V / G tipo nervosas agentes químicos ^16. Para facilitar a embalagem OMV, um plasmídeo bacteriano foi concebido que codifica uma construção de genes que contém um promotor indutível, uma sequência de localização periplasmático, e um local de clonagem múltipla curto a montante da sequência do gene CS. Inserção do gene da TEP entre o líder e a sequência de SC permitido para a criação de um interruptor genético que tem como alvo a proteína de fusão PTE-SC para o espaço periplásmico de embalagem OMV. Enquanto os esforços descritos aqui concentrar em PTE, o gene da enzima é intermutável e pode ser facilmente substituída por outra sequência de gene com o FACilitate embalagem de uma enzima ou proteína alternativa.

À medida que a segunda parte da ligação sintética, uma proteína da membrana externa abundante (OmpA) é escolhido para apresentar a sequência do péptido ST. Embora a escolha de proteína de ancoragem pode variar, é essencial que a proteína tem um domínio permissiva, que apresenta no interior do espaço periplasmático, tolera a construção de fusão sem induzir citotoxicidade, é conhecido por estar presente em OMV, e não se agregar quando é recombinantemente produzido. OmpA kDa é uma proteína transmembranar de porina 37.2 que é conhecida por ser altamente expresso na membrana externa bacteriana e subsequente OMV ^17. Ele está implicado no transporte de moléculas pequenas, <2 nm de tamanho, através da membrana bacteriana ^18. Nativo OmpA tem dois domínios estruturalmente únicos, um motivo barril beta transmembranar e uma porção C-terminal solúvel periplasmically conhecido para interagir com o peptidoglicano ^19. No designe mutante fusão OmpA-STd aqui a porção C-terminal de OmpA foi eliminado e o ST foi fundido com o N- periplasmically virado ou C-terminais. Excluindo a parte periplasmático de OmpA diminui o número de interacções entre a membrana exterior eo peptidoglycan resultando na desestabilização da membrana levando a hiper-vesiculation ^7. OmpA genómico foi mantida para além da construção de OmpA-ST expressa de forma recombinante para mitigar a desestabilização da membrana bruta.

Protocol

1. Preparação dos plasmídeos Prepare um plasmídeo (por exemplo, pET22) contendo a proteína de ancoragem (OmpA) fundido com um domínio de ligação bi-ortogonal (referido no presente protocolo como âncora-ST), tag epitopo (como 6xHis, myc ou bandeira de tags para a purificação e identificação), tag periplasmático localização, a resistência aos antibióticos, e de origem adequada de replicação com base na estirpe bacteriana seleccionada 7. Extrair DNA de plasmídeo …

Representative Results

A expressão simultânea de duas proteínas recombinantes, como é necessário para a estratégia de embalagem OMV detalhado neste protocolo, podem ser realizadas através de um número de diferentes caminhos. Aqui, um sistema de dois vectores foi utilizado com origens de replicação compatíveis e cassetes de genes indutíveis separadas. Para a expressão do PTE-SC construir uma estrutura do plasmídeo comercial (pACY184) foi manipulado para incluir uma cassete de gene indutível arabi…

Discussion

Este protocolo funções para demonstrar um representante dirigido técnica de embalagem em que uma enzima de interesse é produzido e embalado em OMV por E. coli. Tal como com muitas técnicas complexas, existem várias áreas em que o protocolo pode ser modificado para acomodar para uso em diferentes aplicações únicas, algumas das quais são descritas abaixo. Enquanto o mecanismo de OMV embalagem e encapsulamento enzima pode ser adaptado às necessidades específicas existem várias etapas dentro deste pro…

Materials

IPTG	Any		Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose	Any		Can be prepared ahead of time and stored at 4C.
Ampicillin	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
Chloramphenicol	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
TB/LB Culture Media	Any		Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100	Any		One of many potential suitable surfactants.
Baffled culture flasks	Any		The baffles promote higher levels of aeration.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.
Syringe Filter 0.45 µm	Thermo Scientific	60183-221       (30 mm)	Filter diameter will depend on volume of sample.  Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator	New Brunswick	Excella E24	Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.
Sorvall Culture Centrifuge	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific	WX Ultra 90	Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor	Thermo Scientific	AH-629	Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes        (25 x 89 mm)	Beckman Coulter	344058	Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer	Tecan	Infinite M1000	Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS / particle tracking	NanoSight	LM10	Necessary for OMV size distribution and concentration determination.
BL21(DE3)	NEB		Suitable bacterial expression strain.
pET22	EMD Millipore	69744-3	Other plasmids can be used in place of these.
pACYC184	NEB		Other plasmids can be used in place of these.
Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Example kit.