Méthodes pour examiner la lymphe et Gland hémocytes dans<em> Drosophila</em> larves

Summary

Systèmes hématopoïétiques de mammifères Drosophila et partagent de nombreuses caractéristiques communes, ce qui rend la drosophile un modèle génétique attrayant pour étudier l' hématopoïèse. Ici, nous démontrons la dissection et montage du principal organe hématopoïétique larvaire pour l'immunohistochimie. Nous décrivons également des méthodes pour analyser différents compartiments hématopoïétiques larvaires dont hémocytes circulants et des cellules à cristaux sessiles.

Abstract

De nombreux parallèles existent entre les systèmes hématopoïétiques de mammifères Drosophila et, même si la drosophile manque la lignée lymphoïde qui caractérisent l' immunité adaptative des mammifères. Drosophila et hématopoïèse mammifères se produisent dans spatialement et temporellement phases distinctes pour produire plusieurs lignées de cellules sanguines. Les deux systèmes maintiennent des réservoirs de progéniteurs des cellules de sang avec lequel se dilatent ou remplacent les lignées matures. Le système hématopoïétique permet la drosophile et les mammifères à réagir et à s'adapter aux défis immunitaires. Fait important, les régulateurs de la transcription et les voies de signalisation qui contrôlent la production, la maintenance et le fonctionnement du système hématopoïétique sont conservées des mouches à des mammifères. Ces similitudes permettent drosophile à être utilisé pour le développement hématopoïétique génétiquement modèle et la maladie.

Ici , nous analyses de détail d'examiner le système hématopoïétique des larves de drosophile. Dansparticulier, nous décrivons des méthodes pour mesurer le nombre de cellules sanguines et de la concentration, de visualiser une lignée mûre spécifique in vivo, et d' effectuer des immunohistochimie sur les cellules sanguines en circulation et dans l'organe hématopoïétique. Ces tests peuvent révéler des changements dans l'expression des gènes et des processus cellulaires, y compris la signalisation, la survie, la prolifération et la différenciation et peuvent être utilisés pour enquêter sur une variété de questions relatives à l'hématopoïèse. Combinée avec les outils génétiques disponibles chez la drosophile, ces essais peuvent être utilisés pour évaluer le système hématopoïétique à des altérations génétiques définies. Bien que non spécifiquement décrite ici, ces tests peuvent également être utilisés pour examiner l'effet des modifications de l'environnement, telles que l'infection ou l'alimentation, sur le système hématopoïétique.

Introduction

Les mécanismes complexes qui régissent les facteurs de transcription et les voies de signalisation qui coordonnent le développement du système hématopoïétique et un dysfonctionnement dans les maladies hématologiques restent mal compris. Ces facteurs de transcription et les voies de signalisation, ainsi que leur régulation, sont hautement conservées entre la drosophile et l' hématopoïèse mammifère ^1-5. Ainsi , le système hématopoïétique Drosophila représente un excellent modèle génétique pour définir les mécanismes moléculaires contrôlant l' hématopoïèse et maladies hématologiques sous – jacentes.

Semblable à des mammifères, Drosophila générer des cellules sanguines, appelées hémocytes, dans spatialement et temporellement des phases distinctes de l' hématopoïèse. Traditionnellement, on pensait hématopoïèse chez la drosophile se limiter aux phases dans le mésoderme embryonnaire et dans les ganglions lymphatiques des larves. Des études récentes montrent que l'hématopoïèse se produit également dans des larves sessiles clustres et dans l'abdomen adulte ^8/6. Toutes les phases hématopoïétiques produisent deux types d'hémocytes matures: plasmatocytes et les cellules de cristal. Plasmatocytes sont des cellules de type macrophage impliqués dans la phagocytose, l'immunité innée et la guérison des plaies. les cellules à cristaux contiennent des pro-phénoloxydases nécessaires à la mélanisation, une réaction utilisé dans les réponses immunitaires d'insectes et la cicatrisation des plaies. Hématopoïèse larvaire peut générer un troisième type hémocytaire mature, appelée lamellocyte, en réponse à certains problèmes immunitaires telles que l' infection par le parasite guêpe ^9,10. Lamellocytes sont de grandes cellules adhérentes, qui fonctionnent en conjonction avec plasmatocytes et les cellules de cristal, afin d' encapsuler et de neutraliser les oeufs de guêpes définies dans les larves de Drosophila. En l'absence de parasitisme, lamellocytes ne sont pas trouvés dans de type sauvage larves. masses mélaniques ressemblent mélanisées, des œufs de guêpes encapsulées; de nombreuses souches mutantes de Drosophila développent des masses mélaniques en l'absence de parasitisme. La présence de lamellogamétocytes et / ou des masses mélaniques peuvent indiquer des anomalies hématopoiétiques. En effet, le phénotype de masse mélanique a été utilisé pour identifier les gènes et les voies impliquées dans l' hématopoïèse ^11-14.

Le système hématopoïétique larvaire est le plus largement étudié à ce jour. Il est composé d'hémocytes circulant dans l'hémolymphe, les clusters de hémocytes sessiles modelées sous la cuticule et les hémocytes résidant dans le ganglion lymphatique. Le ganglion lymphatique est une série de lobes bilatéraux attachés au vaisseau dorsal. Chaque lobe primaire du ganglion lymphatique est divisée en trois zones principales. La zone la plus extérieure est connue comme la zone corticale et contient maturation hémocytes. La zone la plus interne est appelée la zone médullaire et comprend des précurseurs d'hémocytes de quiescence. La troisième zone, le centre de signalisation postérieure, est un petit groupe de cellules à la base de la glande lymphatique qui agissent comme une niche de cellules ressemblant à la tige. Les premiers travaux mis en place des fonctions critiques pour Notch ^15-18 </sup>, Hedgehog ^19,20, JAK-STAT ¹⁸ et aptère ²¹ activité pour réguler le développement des glandes lymphatiques larvaire. Des études plus récentes ont démontré que la BMP ^{22, FGF-23} Ras et Hippo ^24,25 signalisation fonctionnent également dans le ganglion lymphatique des larves.

Quatre essais de hématopoiétiques larves présentées ici décrivent 1) à mesurer circulant concentration hémocytes, défini comme le nombre de cellules par unité de volume, 2) l' isolement et la fixation de circulation hémocytes pour l' immunohistochimie, 3) visualisant des cellules à cristaux in vivo et 4) disséquant, la fixation et le montage glandes lymphatiques pour l'immunohistochimie. Ces dosages peuvent être utilisés pour évaluer les lectures hématopoiétiques les fonctions et les règlements des voies de signalisation dans le système hématopoïétique des larves. Bien que ces méthodes ont été utilisées précédemment dans le domaine, la documentation visuelle de ces essais a commencé que récemment ^8,26-30. Plusieurs publications citées ici sont l'aideressources ful décrivant des méthodes similaires et les marqueurs hématopoïétiques ^26,31-33. En outre, Trol et Viking sont des marqueurs utiles de la membrane glande lymphatique du sous-sol.

Protocol

1. Circulating Concentration hémocytaire Pour obtenir des larves d'à peu près le même stade de développement pour ce dosage, limiter la collecte des œufs en permettant les femelles à pondre des oeufs pendant une période de temps fixe 2 – 6 h. Recueillir les larves dans disséquant puits plat rempli de phosphate 1x solution saline tamponnée (PBS, tableau 1). Pour chaque larve, placer 10 ul 1x PBS dans un tube à centrifuger sur la glace et 10 pi de PBS 1x sur u…

Representative Results

Circulant hémocytaire Concentration Numéros de hémocytaires augmentent tout au long du développement larvaire 35. Pour illustrer cette méthode permet de détecter des différences dans le nombre d'hémocytes et d'une concentration, quelle que soit la cause biologique, on a mesuré les concentrations de hémocytes des larves retardée et non retardée. Perte de l' hormone prothoracicotropique (de PTTH) …

Discussion

Lors de la modification génétique ou environnementale, les quatre méthodes décrites ici peuvent être utilisés individuellement ou conjointement pour analyser les processus distincts au cours de l' hématopoïèse tels que la signalisation, la survie, la prolifération et la différenciation Drosophila hématopoïèse est un processus dynamique. le nombre d'hémocytes par animal et augmente ³⁵ l'expression de la structure et le gène de la glande lymphatique change ³² pend…

Materials

PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
hemocytometer	Hausser Scientific	3200
trypan blue stain	Life Technologies	T10282
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
6-well plate	Corning	351146
12-well plate	Corning	351143
microscope cover glass, 22 mm square	Fisher	12-544-10
microscope cover glass, 18mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
thermal cycler	Eppendorf	E950010037	Mastercycler EP Gradient S
PCR tubes	USA Scientific	1402-2700
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1